川产姜黄须根大类成分分析及提取工艺优化

陈嘉辉，吉责小平，殷中琼，张 翅，邹元锋*

(1.四川农业大学天然药物研究中心，成都 611130；2.四川省平昌县人民政府，四川 平昌 636400)

姜黄为姜科植物姜黄(Curcumalonga)的干燥根茎，分布于四川、云南及贵州等地[1]。有破血行气，通经止痛之功效[2]。姜黄素是中药姜黄的重要有效成分，其化学结构如图1所示，具有特殊的二酮类结构，可以对活性氧具有抑制作用[3]。目前，姜黄素已被证实有抗炎、抗氧化、降血脂和抗肿瘤等多种药理作用[4-5]，广泛应用于医药保健产业之中。

图1 姜黄素的化学结构式

四川省是姜黄的道地产区，其中犍为、沐川一带气候湿润，种植姜黄已有千年历史，生产面积大，产量占全国姜黄的一半以上[6]。但是，由于疫情冲击，姜黄种植面积萎缩，川产姜黄由于有效成分含量更高[6]，具有更好的药用价值，价格高于云南产姜黄和进口姜黄，存在一定的供需缺口。此外，四川每年生产大量的姜黄须根，大多被弃用，造成极大的资源浪费及环境问题，但是姜黄的非药用部位也含有相似的化学活性成分[7]。因此，加强对姜黄须根的研究和利用是很有必要的。从姜黄中提取有效成分的方法很多，包括溶剂提取法、酸碱提取法、酶提取法和超声波辅助提取法等[8]。溶剂提取法由于其工艺简单，提取成本低，所以本次试验采用溶剂法提取姜黄须根的相应成分。故本试验拟在分析其大类成分组成情况下，采用Box-Behnken设计-响应面分析法优化须根姜黄素的提取工艺，为进一步开发利用姜黄须根以及后期研究奠定基础。

1 材料

1.1 原料

本实验的主要材料为姜黄须根，从乐山犍为县姜黄产区采集，经鉴定为姜科植物姜黄Curcumalonga的须根。

1.2 药品

葡萄糖标准品(分析纯，成都科隆化学品有限公司)；芦丁标准品(纯度≥98%，北京索莱宝科技有限公司)；姜黄素标准品(纯度≥95%，北京索莱宝科技有限公司)；乙醇(分析纯，成都科隆化学品有限公司)；苯酚(分析纯，成都科隆化学品有限公司)；亚硝酸钠(分析纯，成都科隆化学品有限公司)；硝酸铝(分析纯，成都科隆化学品有限公司)。

1.3 仪器

紫外-可见光分光光度计(上海尤君仪器公司)；电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)；恒温干燥箱(成都一科仪器设备有限公司)。

2 方法

2.1 姜黄须根大类成分分析

根据文献[9-11]所示方法，制作葡萄糖、芦丁和姜黄素的标准曲线。

根据文献[8,11-12]所示条件分别提取须根多糖、黄酮和姜黄素。按式(1)中方法计算姜黄须根中大类成分的提取率。

Y=(M0/M)×100%

(1)

式中：

Y——姜黄大类成分提取率，%；

M0——姜黄大类成分的质量，g；

M——姜黄须根的质量，mg。

2.2 姜黄须根姜黄素提取工艺优化

2.2.1 单因素实验 以须根姜黄素的提取率为指标，考察温度、溶剂体积倍数、乙醇浓度、提取时间四个因素对姜黄素得率的影响。

2.2.2 Box-Behnken响应面实验 利用Design Expert 10.0.1软件进行优化设计，根据单因素实验结果，选取其中三个因素为主要考察因素，以须根姜黄素提取率为响应值，设计响应面优化实验。

根据回归模型预测条件进行验证，将该条件重复进行试验三次，判断最终姜黄须根中姜黄素提取率与预测值是否接近，从而得到最佳提取条件。

3 结果

3.1 姜黄须根大类成分分析结果

3.1.1 标准曲线 得到的葡萄糖标准曲线吸光度(y)与浓度(x)的线性回归方程为y=5.7314x-0.0198(R2=0.9956)，在0.01～0.10 mg/mL之间线性关系良好。

得到的芦丁标准曲线吸光度(y)与浓度(x)的线性回归方程为y=3.1x-0.0008(R2=0.9988)，在0.004～0.040 mg/mL之间线性关系良好。

得到的姜黄素标准曲线吸光度(y)与浓度(x)的线性回归方程为y=71.867x+0.0096(R2=0.9976)，在0.001～0.010 mg/mL之间线性关系良好。

3.1.2 大类成分提取率的结果及分析 所得各类成分的提取率如表1所示。可见，通过溶剂回流法，姜黄须根中多糖的平均得率为三者最多，姜黄素的平均得率为三者最低。值得注意的是，朱姗薇[8]等人发现姜黄各个部位姜黄素的含量对进行姜黄属植物的分类学研究具有重要意义，姜黄植物的不同部位姜黄素的含量具有显著差异。所以，对姜黄须根的姜黄素进行提取工艺优化不仅能减少姜黄素的浪费，加强对姜黄资源的保护，还对姜黄属植物的分类学研究具有重要意义。

表1 姜黄须根大类成分提取率汇总

3.2 姜黄须根姜黄素提取工艺优化结果

3.2.1 单因素实验结果

(1)提取温度对姜黄素提取率的影响

结果如图2所示。可见随着温度的升高，姜黄素的溶解率增大，须根姜黄素的提取率增大。当温度达到90℃之后，须根姜黄素的提取率下降。其原因可能是与姜黄素特殊的二酮结构受热分解有关。故本次实验选择温度70～90℃来作为提取工艺优化的响应条件。

图2 提取温度对姜黄素提取率影响图

(2)乙醇浓度对姜黄素提取率的影响

结果如图3所示。可见随着乙醇浓度的升高，须根姜黄素的提取率逐渐增大。当乙醇浓度达到70%之后，姜黄素的提取率逐渐下降。其原因可能是与在不同浓度的乙醇中姜黄素的溶解度不同有关。故本次实验选择乙醇浓度50%～70%来作为提取工艺优化的响应条件。

图3 乙醇浓度对姜黄素提取率影响图

(3)溶剂用量对姜黄素提取率的影响

结果如图4所示，可见随着溶剂用量的增大，须根姜黄素的提取率增大，但当料液比达到1:20之后，增加幅度不大。其原因可能是随着溶剂用量的增大，姜黄素的溶出速率逐渐达到平衡。考虑到节省溶剂，故本次实验选择溶剂用量15～25倍来作为提取工艺优化的响应条件。

图4 溶剂用量对姜黄素提取率影响图

(4)提取时间对姜黄素提取率的影响

结果如图5所示，可见随着提取时间的增大，须根姜黄素溶出到溶剂的含量增多，姜黄素的提取率增大。当提取时间达到60min后，须根姜黄素提取率有所增大，但是幅度不高，可能是因为细胞内外姜黄素渗出渗入逐渐达到了动态平衡。为了提高提取效率，故本次实验选择的提取时间为60min，且不对提取时间进行工艺优化。

图5 时间对姜黄素提取率影响

3.2.2 Box-Behnken响应面实验结果

(1)Box-Behnken实验设计结果

在单因素的实验基础上，利用Design Expert 10.0.1软件进行优化设计，根据 Box-Behnken 的中心组合实验设计原理，选取提取温度(A)、溶剂用量(B)和乙醇浓度(C)三个因素为主要考察因素，以须根姜黄素提取率为响应值，设计三因素三水平的响应面优化实验。实验因素与水平和中心组合设计结果如表2和表3所示。

表2 响应面实验因素与水平

表3 响应面实验中心组合设计及结果

(2)回归方程及方差分析结果

根据Design Expert 10.0.1软件，对所得数据进行回归方程拟合分析，得到的二次回归方程为：姜黄素提取率(%)=0.27+0.015A+0.052B+6.312×10-3C+8.650×10-3AB-2.250×10-3AC-1.325×10-3BC-0.029A2-0.058B2-0.013C2(R2=0.9835)。

F值的大小可体现各个工艺条件对须根姜黄素提取率的影响，因此实验因素对响应值影响大小的顺序如下：B(溶剂用量)>A(温度)>C(乙醇浓度)。

表4 响应面实验方差分析

续表4

(3)响应面曲线图分析结果

本次实验所得到的等高线图和3D曲线图如图6-8所示。可见须根姜黄素的提取率随着任意两个工艺因素的增加而升高，达到最高值后，再随之下降。曲面的最高点均位于等高线范围之内，响应面3D图为开口向下的平滑的曲线，因此，可以选用此模型来预测须根姜黄素提取率的最优条件。

图6 溶剂用量和温度对须根姜黄素提取率的影响

图7 乙醇浓度和提取温度对须根姜黄素提取率的影响

图8 乙醇浓度和溶剂用量对须根姜黄素提取率的影响

(4)最优条件验证

根据回归模型所得到的最佳提取率为：提取温度为83.224℃，料液比为1：22.331，乙醇浓度为61.921%，在此条件下，须根姜黄素提取率最高为0.280%。考虑到实际提取条件，选择提取温度为83℃，料液比为1:22，乙醇浓度为60%的条件下进行验证实验，得到的须根姜黄素提取率为0.277%，相对误差为1.64%，与预测值接近，表明此回归模型有效、可靠，可用于须根姜黄素的提取。

4 讨论与结论

姜黄素广泛应用于医药、食品和纺织行业，具有极高的经济价值，预计2022年全球姜黄素的市场将高达0.94亿美元[13]。目前研究主要集中在对姜黄根茎的研究，对姜黄非药用部位的研究较少。川产姜黄品质较好，随着对姜黄素需求的增大，加强对川产姜黄非药用部位的研究，可以有效避免药材的浪费，提高全药材的利用度。提取姜黄须根中的大类成分，从而为姜黄的深入加工和药材资源的合理应用提供依据。采用溶剂法提取姜黄须根的大类成分，工艺简单，并且可以在较低的提取成本下，达到较好的药材利用效果。并辅以响应面分析法，优化须根中姜黄素的提取条件，达到对姜黄中姜黄素的更好利用。

实验选择在合适条件下，对姜黄须根的多糖、黄酮和姜黄素成分进行提取，三者的平均得率分别为2.33±0.05%，1.00±0.02%和0.24±0.01%。不仅姜黄素具有极好的抗氧化能力，侯敏娜等[14]通过体外抗氧化试验，发现姜黄多糖和黄酮也具有良好的抗氧化效果，使得对DPPH自由基的清除率显著下降。因此，加强对姜黄非药用部位的研究是有重要价值的。通过响应面优化实验，各提取因素对须根姜黄素提取率的影响为：B(溶剂用量)>A(温度)>C(乙醇浓度)，与单后松[15]等人研究的各因素对姜黄素提取率影响相同。对最佳条件进行修正后，在提取温度为83℃，料液比为1:22，乙醇浓度为60%的条件下得到须根姜黄素的最佳提取率为0.277%，与预测值0.280%相近。说明本次实验所得到的模型可靠，可以依据此模型来选择须根姜黄素的最优提取条件。