榨菜根肿病菌拮抗菌株的分离筛选及促生特性分析

唐恺言,何砚秋,申枚琳,黄 琴,韦宇新，黄 锐,赵 珂

(四川农业大学资源学院微生物学系，成都 611130)

根肿病自1737年于英国地中海西岸和欧洲南部发现以来，已对世界各地十字花科作物的生产和发展带来了严重影响。随着我国近年来对十字花科作物栽培数量和种类的不断扩大，十字花科植物根肿病的发生概率和面积也在不断上升[1-2]。根肿病是由专性寄生菌芸薹根肿菌(PlasmodiophorabrassicaeWoron)导致的土传性病害[3]。根肿病菌可通过昆虫活动、灌溉水流动、带病植株等多种方式在十字花科植物中进行传播，其休眠孢子囊可在土壤存活8～15年，病菌极强的传染性以及孢子超长的存活能力等原因导致根肿病的防治工作非常困难[4]。

对于根肿病的防治技术，目前主要集中在化学农药筛选、田间管理、抗病植株培育等方面[5]。化学药剂虽然可以一定程度上杀死病原菌，但长期施用易造成土壤环境污染[6]。此外通过施用生石灰、轮作等田间管理手段也极耗人力、物力，抗病植株的筛选更需要较长时间，且由于病原菌存在生理小种，培育出的抗病植株也无法大规模耕种[2, 7]。近年来随着农业生产投入加大，生物防治因其高效、安全、成本低廉等特点在农业病害防治中备受关注。研究表明植物内生枝顶孢属真菌(Acremoniumalternatum)、枯草芽抱杆菌XF-1(Bacillussubtilis)、放线菌等对根肿病的防治都具有显著效果[8-11]。芽孢杆菌作为生物防治领域的典型代表可通过竞争、分泌抗菌或溶菌物质、诱导植物产生抗性等多种方法对植物病害进行防治。本研究以主要的十字花科作物榨菜为研究对象，采集成都平原主要榨菜种植区的植株根际土壤，分离榨菜根际土壤中的芽孢杆菌，并筛选具有抗根肿病和促生潜力的菌株。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品来源 实验所用根际土土壤样品、患病榨菜的根组织、榨菜种子均采集自成都郫县唐昌镇柏木村榨菜种植区。

1.1.2 仪器设备 采用电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)对样品进行干燥处理；采用全自动蒸汽灭菌锅(北京发恩科贸有限公司)进行高压蒸汽灭菌；采用光学显微镜(ZEISS公司)进行根肿菌休眠孢子活性观察。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基配制 根际芽孢杆菌分离培养基：LB培养基，分别加入制霉菌素50mg/L；纯化保种培养基：LB培养基；根肿病菌拮抗菌株初筛培养基。MM-Chitin培养基；根肿病菌拮抗菌株复筛培养基：LB液体培养基。

1.2.2 根际芽孢杆菌分离、纯化 将采集的根际土样用80℃高温预处理10min后用无菌水稀释成10-4、10-5、10-6共3个浓度梯度。分别取100μL菌悬液均匀涂布于3种分离培养基，每组重复3次。涂布后的平板置于28℃恒温培养箱培养2～3d。对分离出的具有不同形态的细菌菌落进行纯化，并进行革兰氏染色[12]，在光学显微镜下观察菌株的颜色及显微形态，去除非芽孢杆菌的菌株。将镜检后的纯培养芽孢杆菌菌株用LB斜面试管保存备用。

1.2.3 根肿病菌拮抗菌株初筛 菌株初筛以其产几丁质酶的强度作为标准，供试菌株产几丁质酶的活性检测方法参照刘翠萍等的方法。

1.2.4 根肿病菌拮抗菌株复筛 菌株复筛以其对病原菌休眠孢子囊活性的抑制情况和对病原菌根毛侵染抑制情况进行检测。

1.2.5 菌株促生功能检测 菌株产IAA能力参考Gordon[13]方法进行测定；定性测定菌株产铁载体能力参照Schwyn和Shin[14-15]的方法进行；菌株溶磷能力采用PKO培养基进行检测[16]；菌株降解纤维素能力采用纤维素刚果红培养基进行检测[17]；菌株产蛋白酶活性采用无脂蛋白酶培养基进行检测[18]；菌株固氮能力采用NFM无氮培养基进行检测[19]。

1.3 数据处理

采用Excel 2013和SPSS 20.0软件对所有试验数据进行分析。

2 结果

2.1 根际芽孢杆菌的分离与纯化

从根际土壤样品中共分离获得110株菌，通过观察菌株菌落形态以及显微镜特征，如菌株细胞革兰氏染色情况、产芽孢情况等，对分离得到的菌株进行形态学初步鉴定。结果显示有86株菌为芽孢杆菌，菌落大多呈乳白色，表明具有褶皱或粗糙，质地干燥，少数菌株具有分泌粘液、色素的特性，显微镜下观察到菌株革兰氏染色为阳性，且大部分菌体中央有卵圆状芽孢(图1)。

图1 芽孢杆菌形态

2.2 根肿病菌拮抗菌株初筛

对根际芽孢杆菌产几丁质酶活性检测结果表明，分离出的86株菌株中有18株芽孢杆菌菌落周围出现了不同大小的透明水解圈，其中菌株A1的水解圈最大，水解圈>15mm，此外菌株A2、A5、A7三株菌产几丁质酶能力也较强，水解圈>10mm(表1)。

表1 菌株产几丁质酶活性检测结果

2.3 根肿病菌拮抗菌株的复筛

2.3.1 病原菌休眠孢子囊活性的抑制检测结果 对筛选的28株产几丁质酶的芽孢杆菌进行病原菌休眠孢子囊活性抑制实验，通过显微镜镜检失活休眠孢子囊数，并统计失活率(表2)。经沸水浴致死处理后失活率达86%，对照组失活率为4.80%，实验组失活率在3.47%～13.56%之间，其中菌株A14、A5、A23、A10、A22、A13这6株菌株对休眠孢子囊的活性抑制率明显高于对照组，且A14抑制率最高，为13.56%，表明这6株菌具有潜在抑制休眠孢子囊活性的能力。

表2 菌株对休眠孢子囊活性的抑制结果

2.3.2 病原菌根毛侵染抑制检测结果 对筛选的6株具有潜在抑制病原菌休眠孢子囊活性的菌株进行根毛侵染抑制实验，通过对根毛染色观察分别统计处理7d和14d后的受侵染率(表3)。结果表明处理7d后实验组侵染率为14.00%～53.33%，其中菌株A5处理(14.00%)明显低于对照组(59%)；处理14d后，实验组侵染率为34.23%～80.00%，菌株A5(42%)、A10(34.23%)两个处理组明显低于对照组(87.66%)，表明A5和A10两株菌对于抑制病原菌侵染根毛具有一定能力。

表3 菌株对根毛侵染的抑制效果

2.4 菌株促生功能检测结果

对筛选的6株具有潜在抑制病原菌休眠孢子囊活性的菌株进行促生功能检测(表4)。结果表明6株菌均可产IAA，其中菌株A5产IAA浓度最高，达到了13.20mg/L。6株菌中只有A10、A14、A22具有固氮能力，溶磷检测结果显示除A10和A23外，其余4株菌均具有溶磷效果，但溶磷能力并不强，溶磷水解圈均低于5mm。产铁载体能力检测结果显示除A23外其余5株菌都能产生铁载体，其中菌株A22水解圈最大。产蛋白酶检测结果显示除A14以外其余菌株均具有产蛋白酶能力，且都大于10mm，说明这些菌株以利用蛋白质作为碳源的能力较强。降解纤维素能力检测结果显示，6株菌纤维素降解圈都大于10mm，都有高效降解纤维素能力，6株菌都具有2种及以上的促生功能。

表4 菌株促生功能检测结果

3 讨论

芽孢杆菌广泛分布于土壤、水、空气等自然环境中，因具有抗逆性极强的内生孢子而具有较强生命力。研究表明芽孢杆菌在代谢过程中会产生多种有机物质，不仅能够抑制病原菌的生长还能对农作物的生长起到良好促进作用[20]。周京龙等[21]研究发现蜡状芽孢杆菌在防治棉花枯萎病的同时对其还具有促生能力。Lahlali等[22]发现了一株对油菜根肿病具有良好防治效果的枯草芽孢杆菌(BacillussubtilisQST713)。本研究对分离自榨菜根际土壤的芽孢杆菌进行了根肿病病原菌抑菌性实验以及促生功能分析，结果表明86株根际芽孢杆菌中仅有18株菌具有产几丁质能力，对18株菌进行病原菌休眠孢子囊活性的抑制检测实验，发现仅有6株菌对孢子活性具有明显抑制效果，且6株菌都具有产IAA和纤维素酶能力，其中A5的IAA产量最高，为13.20mg/L，除固氮能力外，A5其余促生功能指标都较好。

休眠孢子囊的萌发是导致根肿病泛滥的重要原因，通过使休眠孢子囊失活可有效降低根肿病的发生。将筛选的18株产几丁质酶根际芽孢杆菌制备成菌液处理榨菜根肿病原菌休眠孢子囊，结果显示仅有A5、A10、A13、A14、A22、A23 6组处理的休眠孢子囊失活率明显高于对照组(4.80%)，具有使休眠孢子失活的潜力，其失活率为9.54%～13.56%。刘翠萍等[23]在对甘蓝根肿病的生防菌筛选结果中显示其筛选出的菌株对休眠孢子囊的失活率为14.23%～31.36%，远高于本研究的最高失活率，但其对照组失活率(21.84%)也远高于本研究的4.80%，这种差异可能与病原菌的植物寄主不同、采样地区差异等因素有关。对6株具有显著失活效果的菌株进行不同时间病原菌根毛侵染抑制实验，结果表明随着处理时间的延长，病原菌根毛的侵染率呈上升趋势，处理7d后只有菌株A5处理(14.00%)显著低于对照组(59%)，处理14d后，菌株A5(42%)和A10(34.23%)2个处理组显著低于对照组(87.66%)，表明A10和A5号菌对于抑制病原菌侵染根毛具有一定能力。这可能是因为相较于其他几株菌，A10和A5有更高的吸附根系的能力，定值能力强，更大的占领了植物根系表面的生态位，并产生更丰富的次生代谢物，对病原菌的侵染有更强的抑制效果[24-25]。

根际微生物可通过分泌多种代谢物促进植物生长进而达到抑制病害侵袭的，增强植物抗病的作用[26]。本研究对筛选出的6株对根肿病具有防治潜力菌株开展了促生功能检测，结果显示6株菌均具有降解纤维素和产IAA的能力，且纤维素水解圈都大于10mm，除A14外，其余5株菌均具有产蛋白酶能力，除A23外其余5株菌均具有产铁载体能力，6株菌中分别有4株菌具有溶磷能力和3株菌具有固氮能力。筛选的两株具有抗根肿病潜力的菌株A10和A5都具备5种促生功能。因此，芽孢杆菌A5和A10在抑制榨菜根肿病，促进榨菜生长上具有一定潜力，结果可为十字花科植物根肿病生防试剂菌株资源的筛选提供科学参考。

4 结论

从榨菜根际土壤中共分离出86株根际芽孢杆菌，其中仅有18株菌具有产几丁质酶能力，对这18株菌进行病原菌休眠孢子囊活性的抑制检测实验，选出了6株与对照组相比具有显著抑制效果的菌株，在此基础上对6株菌病原菌根毛侵染抑制实验以及菌株促生功能进行了探究。综合比较结果获得了具有较好抗菌能力及促生效果的两株根际芽孢杆菌菌株为A5和A10。