神经丝轻链蛋白和炎症细胞因子对临床孤立综合征复发的预测价值*

梁军利，丘小慧，梁津瑜，唐士婷，罗杰峰

（广西医科大学第二附属医院，南宁 530007）

临床孤立综合征（clinically isolated syndrome，CIS）是指单次发作的中枢神经系统脱髓鞘疾病，易转化为多发性硬化（multiple sclerosis，MS）[1-2]。CIS和MS 治疗策略和预后差异显著，早期疾病修正治疗可以延迟CIS向MS转化[3]，所以，积极探寻CIS复发及转归为MS 的标志物，对复发风险高的CIS 患者早期干预，最大程度减少复发，降低神经功能损害有重要的临床意义。神经丝轻链蛋白（neurofilament light chain，NfL）是MS炎症活动和神经轴突损伤的标志物[4-5]，但其是否在CIS 阶段升高，是否为CIS 早期炎症和轴突损伤的潜在标志物，目前尚无研究证实。Th17是一类不同于Th1和Th2的T辅助细胞，在白介素-23（interleukin-23，IL-23）诱导下产生的多种炎症细胞因子白介素-17A（interleukin-17A，IL-17A）、白介素-21（interleukin-21，IL-21）、白介素-22（interleukin-22，IL-22）、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白介素-6（Interleukin-6，IL-6）IL-6 等与MS 发病密切相关[6]。国外研究发现，CIS 及CIS 转化为MS 的患者血清中NfL水平均增高，提示CIS存在轴突损伤[7]。脑脊液中NfL 增高可能是复发缓解型多发性硬化症（relapsing-remitting multiple sclerosis，RRMS）活动性的生物标志物[8]。但NfL 与CIS发病机理，以及与Th17 相关炎症细胞因子相关性的研究鲜有报道。本研究旨在探讨NfL 和Th17 相关炎症细胞因子在CIS 发病及转归为MS 的预测价值，以及NfL 与Th17相关炎症细胞因子的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2017 年12 月至2021 年12 月在广西医科大学第二附属医院住院的96 例CIS 患者作为研究对象（CIS组）。病例纳入标准：（1）CIS符合McDonald（2017）的诊断标准[9]。当CIS 复发时满足Mc-Donald（2017）标准和多发性硬化诊断和治疗中国专家共识（2018 版）[9-10]，诊断为MS；（2）年龄在18～70岁；（3）首发症状急性期1周内入院；（4）发病前3个月内未给予任何免疫治疗；（5）细胞间接免疫荧光法检测血清水通道蛋白4（AQP4）抗体和抗髓鞘少突胶质细胞糖蛋白免疫球蛋白G 抗体（MOG-IgG）阴性。排除标准：合并颅内外感染的急性期患者，或合并其他免疫相关疾病患者。选取年龄、性别相匹配的神经系统非炎症疾病（non-inflammatory neurological disease，NIND）住院患者30例作为对照组，其中紧张型头痛9例，周期性麻痹21例。对照组排除标准同CIS 组，且头颅CT或MRI正常，脑脊液常规、生化、细胞学正常，寡克隆区带阴性。本研究已通过本院伦理监察委员会审查，所有参加本研究的患者均充分了解研究目的及注意事项，患者本人或其家属已签署知情同意书。

1.2 治疗方法

CIS 组患者均给予激素治疗（甲泼尼龙针0.5 g静脉滴注，1 次/d，3 d 后减量为250 mg 静脉滴注，1次/d，2 d后减量为120 mg静脉滴注，3 d后改为强的松片口服，1 mg/kg，渐递减后1～3个月停服）。同时给予制酸、补钙、补钾治疗。除急性期激素治疗外，随访期间未给予免疫药物治疗。

1.3 观察指标及随访

记录两组患者性别、年龄。记录CIS 组患者头和脊髓MRI病灶部位，扩展残疾状态量表（extended disability status scale，EDSS）；腰穿脑脊液检查脑脊液白细胞计数、总蛋白、寡克隆带（oligoclonal band，OB）。NfL 和Th17 相关炎症细胞因子水平测定：两组患者均在急性期（入院第2 天凌晨6 点）采肘静脉血5 mL，腰穿抽取脑脊液3 mL，立即经4 000 r/min 离心5 min，取上清液分装于分离管内，标记，-80 ℃冻存待测。采用全制动酶免仪（雷勃公司，芬兰）按照酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（R&D Systems 公司，美国），NfL 和Th17 相关炎症细胞因子水平说明书给予包被、封闭酶标反应孔，然后加入待检测样品、酶标抗体、底物液，最后加入终止液显色，终止反应后读数。CIS 组患者每周电话随访1 次，3 个月门诊随访1 次，如果出现新发症状或原有症状加重，改为住院治疗。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件对所有数据进行统计分析，正态分布的计量资料采用均数±标准差（）表示，两组间差异比较用t检验，计数资料以频数或百分率表示，组间比较采用卡方检验或Fisher 精确概率法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 纳入研究者基线及CIS组随访情况

CIS 组患者中男33 例，女63 例，平均（33.13±8.86）岁，EDSS（1.53±0.97）分；对照组患者中男11例，女19 例，年龄（31.17±5.78）岁，两组患者性别、年龄比较差异无统计学意义（P＞0.05）。CIS 的诊断及分型[11]：大脑型占45.83%（44 例），脊髓型占29.17%（28 例），视神经炎型占12.50%（12 例），脑干型占9.37%（9例），小脑型占3.13%（3例）。CIS组患者随访中位数时间24.07 个月（失访4 例），根据McDonald（2017）等诊断标准[12-13]，诊断MS 57例（59.38%），其中临床确诊MS 49 例，实验室检查确诊MS 8 例，复发后EDSS（2.57±0.85）分。复发患者与未复发患者基线情况、CIS分型和脑脊液检查的比较，见表1。

表1 复发与未复发患者基线资料的比较

2.2 两组血清和脑脊液中NfL和Th17相关炎症细胞因子水平的比较

与对照组比较，CIS 组患者血清和脑脊液中NfL、IL-17A、IL-23、IL-21、IL-22 水平增高，而血清和脑脊液中TGF-β 降低，血清中IL-6 降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1、图2。

图1 两组患者血清和脑脊液中NfL与Th17相关炎症细胞因子水平

图2 两组患者血清和脑脊液中NfL与Th17相关炎症细胞因子水平

2.3 转归为MS患者与未复发CIS患者基线NfL和Th17相关炎症细胞因子水平的比较

与未复发CIS 患者比较，转归为MS 患者基线脑脊液中NfL、IL-17A、IL-23水平增高，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3、图4。

图3 转归为MS患者与未复发CIS患者血清和脑脊液中NfL与Th17相关炎症细胞因子水平

图4 转归为MS患者与未复发CIS患者血清和脑脊液中NfL与Th17相关炎症细胞因子水平

2.4 转归为MS 患者未复发前及复发后NfL 和Th17相关炎症细胞因子水平的比较

与转归为MS 患者未复发前比较，复发后脑脊液中NfL，血清和脑脊液中IL-17A、IL-23水平增高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图5、图6。

图5 转归为MS患者未复发前及复发后血清和脑脊液中NfL与Th17相关炎症细胞因子水平

图6 转归为MS患者未复发前及复发后血清和脑脊液中NfL与Th17相关炎症细胞因子水平

2.5 CIS转归为MS患者未复发前及复发后血清和脑脊液中NfL和Th17相关炎症细胞因子相关性

CIS转归为MS患者血清和脑脊液中NfL与IL-17A、IL-23、IL-21、IL-22、TGF-β、IL-6无相关性。

3 讨论

CIS是一种以中枢神经系统炎性脱髓鞘为主要特征的临床综合征。本研究纳入的96 例CIS 患者中，女性是男性的1.91倍，以青年多发，大脑型和脊髓型病变占大多数。经随访发现，59.38%的CIS 患者转化为MS，起病年龄小，脑脊液细胞数和蛋白增高，OB 阳性CIS 患者易复发，这与Calabrese 等[1]研究的结果相似。

本研究发现，CIS患者NfL水平增高，与未复发CIS患者比较，转归为MS患者血清和脑脊液中NfL基线水平增高，复发后脑脊液中NfL 水平更高。既往研究发现，NfL 是神经元轴突细胞骨架的主要组成部分，被认为是神经轴突损伤和退行性变的生物标志物[5,11]。脑脊液中NfL水平可以用作MS严重程度的标志物，甚至可以用作MS的预后标志物[4]。血清中高的NfL 水平与MS 炎症性疾病活动、脑磁共振成像和临床残疾评分相关[5]。疾病修正疗法可以降低RRMS患者的NfL水平[14-15]。这样看来，NfL是MS活动、进展和治疗反应的生物标志物，也是预测CIS复发的标志物。

既往研究认为IL-10和IL-12在MS发病中发挥重要作用[16]。新近研究显示，一种以分泌IL-17（主要为IL-17A）为特征的Th17与MS自身免疫反应有关，并提出了IL-23/IL-17 轴发病机制学说[17]。IL-23、IL-21、IL-22、TGF-β、IL-6 促使Th17 分化，是Th17 相关炎症细胞因子[18]。本研究通过对比检测CIS患者、转归为MS患者未复发前及复发后血清和脑脊液中Th17相关炎症细胞因子水平，与对照组比较，CIS 患者血清和脑脊液中NfL、IL-17A、IL-23、IL-21、IL-22 水平增高，而血清和脑脊液中TGF-β，脑脊液中IL-6 减低。与未复发CIS 患者比较，转归为MS 患者基线脑脊液中IL-17A、IL-23 水平增高，提示脑脊液中IL-17A、IL-23 增高的CIS 患者易复发。与转归为MS 患者未复发前比较，复发后血清和脑脊液中IL-17A、IL-23 水平明显增高，提示血清、脑脊液中IL-17A、IL-23 水平可能性预测CIS 转化为MS的炎性标志物，这也提示阻断IL-17A、23炎症通路，有可能阻断CIS向MS转化。

IL-17A、IL-23、IL-21、IL-6、TGF-β 之间存在复杂的炎症细胞因子网络，诱导炎性反应。既往研究发现，IL-17A 是主要由Th17 产生的具有广泛生物学活性的早期炎症细胞因子。它可刺激成纤维细胞、内皮细胞分泌各种炎症细胞因子，如IL-6、IL-8、前列腺素E2，诱导炎性反应[18]。有研究显示，人小胶质细胞可激活T 细胞，通过分泌IL-23，诱导IL-17A的分泌，促进Th17反应[19]。Th17通过信号转导子与转录活化子3途径分泌IL-21，而IL-21联合IL-6 通过信号传导与转录激活因子3 和孤核受体作用促进Th17 的分化，并能增加L-23 受体的表达[20-21]。TGF-β 及IL-6 能够启动Th17 初始分化，刺激Th17产生IL-17A[22]。研究显示，IL-22作用于血脑屏障内皮细胞上的IL-22 受体，使外周的Th17 快速通过破坏的血脑屏障进入中枢神经系统，高表达颗粒酶杀伤神经元，加重中枢神经系统炎性反应[21]。虽然NfL 代表了神经轴突损伤，但本课题组并未发现其与Th17相关炎症细胞因子的相关性，亦未见相关研究报道。

综上所述，CIS 患者已出现NfL、IL-17A、IL-23水平增高，提示CIS 存在神经轴突损伤和炎症细胞因子分泌增高。转归为MS 患者基线脑脊液中NfL、IL-17A、IL-23 水平明显增高，复发为MS 后脑脊液中NfL 水平，以及血清和脑脊液中IL-17A、IL-23 水平明显增高，提示其是预测CIS 复发的潜在标志物，阻断IL-17A/IL-23 通路，可能能抑制CIS 向MS转化。