电针“内关”、“足三里”对脑梗死大鼠梗死体积及尼氏小体的影响*

王斌华，吴新贵，刘学谦，潘 剑

（广西医科大学第一附属医院，南宁 530021）

急性脑梗死（acute cerebral infarction，ACI）是我国最常见的一种脑血管疾病，且其发病率、致残率、致死率较高，据中国国家脑卒中筛查数据显示，我国40～74 岁人群首次急性脑梗死标化发病率由2002年的189/10万上升到2013年的379/10万，平均年增长8.3%[1]，严重危害人们的劳动能力和生活质量[2]。脑梗死可归纳于中医“卒中”或“中风”范畴。中国很早就有使用针灸疗法来治疗卒中的记载，最早可见于《黄帝内经》，如《灵枢·热病》：“偏枯，身偏不用而痛……巨针取之，益其不足，损其有余，乃可复也”。其后的《针灸甲乙经》及《针灸大成》也有针灸治疗卒中的描述，《针灸甲乙经》：“偏枯，四肢不用，善惊，大巨主之”；《针灸大成卷五·八脉图》：“中风偏枯，疼痛无时：绝骨、太渊、曲池、肩髃、三里、昆仑”等。电针疗法是现代技术与传统医学相结合的产物，操作时将针刺入穴位获得针感后，在毫针针柄上接通电针仪上的电线，利用针刺和脉冲电刺激相结合以防治疾病的方法。此疗法的优点就是能代替人工操作，节省人力，又能控制刺激量。接通电流后逐渐调整电流大小，调节到患者能耐受的程度。电针有止痛、镇静、促进气血循环、调整肌张力等作用，电针疗法已被广泛的应用于临床中。大量的临床研究和基础研究[3-4]都证实电针疗法是针对脑梗死安全、有效、可行的治疗方法。本课题组前期研究发现[5-6]，电针能够改善脑梗死大鼠肢体运动功能、促进脑梗死大鼠脑梗死区及梗死对侧大脑生长相关蛋白GAP-43（growth associated protein-43）的表达，减轻脑梗死双侧神经细胞的损伤。

尼氏小体是仅存在于神经元细胞胞体中及树突内的一种颗粒，它的数量及形态与神经元受损伤程度成正比，因此常被用来作为评价神经元功能正常与否的指标。课题组前期研究还发现，电针可以促进局灶性脑梗死大鼠梗死对侧的尼氏小体增加，进而使局灶性脑梗死大鼠运动功能得到恢复[7]。大脑中动脉梗塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠梗死侧大脑皮层的梗死体积及尼氏小体数量的增减变化与脑梗死后运动功能的恢复有何联系，以及电针干预对这种联系的影响如何，未见相关研究。本实验选取“内关”、“足三里”两穴进行电针干预，观察MCAO大鼠梗死侧大脑皮层的神经细胞尼氏小体的增减变化、脑梗死体积及其与脑梗死后运动功能的恢复之间的关系，为临床运用电针治疗脑梗死提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

使用健康的成年雄性SPF级SD（Sprague-Dawley，SD）大鼠54只，体重240～300 g，大鼠年龄在7～8周之间（合格证号：SCXK桂2020-0003），由广西医科大学实验动物中心提供。每笼饲养6 只大鼠，饲养1周，期间自由进食饮水，采用颗粒型普通大鼠饲料喂养，术前禁食不禁水12 h。将54 只SD 大鼠随机分为假手术组（n=18）和手术组（n=36），手术组制备MCAO 模型，模型制备成功后，将符合标准的大鼠随机分为模型组和电针组，每组18只。

1.2 主要实验试剂及仪器

2%TTC 染色液（中国武汉赛维尔科技有限公司）；医用华佗牌毫针0.3 mm×13 mm、电子针灸治疗仪（中国江苏苏州医疗用品厂有限公司）；尼氏染色液（中国武汉赛维尔科技有限公司）；4%多聚甲醛缓冲液（中国广西北一生物科技有限公司）；手术器械（中国上海医疗器械有限公司）；线栓（中国广州佳灵生物技术有限公司）；3.0缝合线及缝合针（中国广西北一生物科技有限公司）。

1.3 MCAO模型造模方法

采用Zea 等[8]改良线栓法制备大鼠右侧MCAO模型。术前12 h 禁食不禁水，以10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）对大鼠进行腹腔麻醉，待大鼠完全麻醉后，仰卧固定，行颈外侧切口，钝性分离肌肉及筋膜，暴露右侧颈总动脉（CCA）、右侧颈外动脉（ECA）和右侧颈内动脉（ICA），用3.0的缝合线扎紧CCA 和ECA，在ICA 近CCA 的分叉处备线，在距CCA 分叉3～5 mm 处用眼科剪剪一小口，然后将线栓缓缓经CCA 插入ICA，当线端插入ICA 约1.7～2.1 cm（线栓上有一黑点，黑点到分叉即可）时，收紧备线，剪去线栓多余末端，常规用碘伏消毒，缝合颈部皮肤，待大鼠完全清醒后放回笼中，自由进食饮水。MCAO大鼠模型制备成功与否的判定参考Bederson 等[9]4分5级法，即待大鼠麻醉清醒后，在24 h 内有：（1）大鼠左侧的上下肢肢体受痛刺激后，肢体不能正常收缩；（2）大鼠不能走直线，并且身体向左倾倒或者向左侧转圆圈；（3）提住大鼠尾巴末端时，左上肢屈曲，不能向前伸直；普遍认为只要大鼠具备以上两条症状表现时，则表明成功制备了MCAO大鼠模型。

1.4 电针治疗方法

造模成功24 h后开始对大鼠进行电针治疗，取穴：参照华兴邦等[10]编制的《大鼠穴位图谱的研制》定位“内关”、“足三里”两穴位，具体为取俯卧位固定大鼠，定位大鼠双侧上肢的“内关”穴（前肢内侧，离腕关节约3 mm 左右的尺桡骨缝间），双侧下肢“足三里”穴（膝关节后外侧，在腓骨小头下约5 mm处）。以28 号0.5 寸无菌针灸针（13 mm×25 mm）快速直刺入穴位皮肤表层后放手，“内关”穴约刺入3 mm，而“足三里”穴刺入深度约为5 mm。脑梗死电针治疗组双侧“内关”穴及“足三里”穴分别接入电子针灸治疗仪（苏州医疗用品有限公司），波形采用疏密波，电流1 mA，刺激频率为2/15 Hz，以大鼠肌肉轻微抖动，不嘶叫为度。疗程：每日治疗1 次，每次留针20 min，分别治疗3 d、7 d、14 d后取材。假手术组与模型组不给予任何干预措施。

1.5 观察指标

1.5.1 大鼠神经功能缺损评分 由同一名熟练掌握改良版大鼠神经功能缺损评分的技术员分别对造模成功3 d、7 d、14 d 的大鼠进行评分，主要评分包括提尾实验（0～3 分），感觉实验（0～2 分）、行走实验（0～3分）、平衡木实验（0～6分）及反射和异常活动实验（0～4分），共18分，正常SD大鼠为0分，神经功能缺损评分在1～6 分为轻度损伤，7～12 分为中度损伤，13～18 分为重度损伤，评分越低，代表神经功能缺损程度越轻[11]。

1.5.2 TTC 染色技术检测脑梗死体积 TTC 染色能够既直观又客观的显示大鼠脑梗死后脑组织的梗死体积，是用来评价脑缺血损伤程度的常用指标。正常脑组织会被染成鲜红色，而梗死灶区域脑组织被染成苍白色。各组在脑梗手术后3 d、7 d、14 d分别随机抽取大鼠3只，以10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）腹腔注射完全麻醉大鼠后迅速开颅取脑，取出的大脑在-4 ℃的冰箱冻存20 min后，放置在冰面上用刀片垂直切除小脑、嗅球，然后从额极始沿冠状面垂直将大脑分别切成约2 mm 厚的脑片，切完共6片，以备TTC染色。

1.5.3 尼氏染色观察脑组织形态 尼氏小体是仅存在于神经元胞体内的嗜碱性颗粒群，它和神经元的功能极为密切，当各种诱发因素导致神经元受损害变性时，尼氏小体颗粒可出现数量及位置的变化，呈明显的溶解或消失。损害消失时，尼氏小体可恢复正常，这说明尼氏小体与神经损害密切相关，因此尼氏小体结构的变化可作为神经元受损的标志。各组在术后3 d、7 d、14 d时分别随机抽取大鼠3 只，以10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）腹腔注射完全麻醉大鼠后，将针从心尖插入至升主动脉，灌注约100 mL 生理盐水，使大鼠全身血液排尽，改用冷的4%多聚甲醛约100 mL灌注固定脑组织。快速断头取脑，将取出的脑组织置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后，进行脱水、透明、浸蜡、包埋，冠状连续切片，随后行尼氏染色，最后在光学显微镜下观察梗死侧大脑皮层运动区的病理形态变化。

1.6 统计学方法

采用SPSS 26.0 版软件进行数据统计与分析。计量资料用均数±标准差（）描述，当满足正态分布和方差齐性时，两组比较用独立样本t检验，多组比较用单因素方差分析；若资料不符合正态分布且方差不齐时，则采用非参数检验。计数资料采用百分比或率来描述，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠神经功能缺损评分

术后3 d，电针组、模型组的神经缺损评分最高，在7 d、14 d 时，模型组和电针组的神经功能缺损评分均呈下降的趋势。与假手术组比较，模型组和电针组在不同时间点的神经功能缺损评分均有显著的提高（均P＜0.05）；与模型组相比，电针组3 d，7 d神经功能缺损评分无明显差异（P＞0.05），电针组14 d 的神经功能缺损评分则有明显的降低（P＜0.05），见表1。

表1 不同时间点各组大鼠神经功能缺损评分比较

表1 不同时间点各组大鼠神经功能缺损评分比较

与假手术组同一时间点比较，*P＜0.05；与模型组同一时间点相比，△P＜0.05。

2.2 大鼠脑梗死体积

电针组大鼠脑组织经TTC染色后，大脑皮层非梗死区域脑组织染色呈鲜红色，梗死区域脑组织染色呈苍白色，且梗死灶多分布于皮层感觉运动区；在3 d 时，电针组与模型组脑梗死体积变化差异不显著（P＞0.05），而电针组7 d 和14 d 的脑梗死体积相较于模型组则有明显的减小（P＜0.05），见图1、图2。

图1 TTC染色大鼠电针不同时间点脑梗死体积

图2 不同时间点各组大鼠脑梗体积百分比

2.3 大鼠脑组织形态学改变

模型组、电针组不同时间点大鼠大脑皮层脑组织经尼氏染色后，模型组与电针组的神经细胞在术后3 d均严重肿胀变形，核周的尼氏小体数量减少，大量神经元细胞破碎，胞核分离，模型组与电针组脑组织形态学改变相似；术后7 d，模型组和电针组的神经细胞仍有破碎，细胞肿胀变形，但两组均出现少量尼氏小体，且电针组尼氏小体数量较模型组多。术后14 d，模型组与电针组尼氏小体数量增多，神经元细胞轻度肿胀，胞核完整，且与模型组相比，电针组神经细胞形态较完整，尼氏小体细胞排列较密集，呈片状分布，见图3。

图3 不同时间点各组大鼠梗死侧脑组织尼氏染色（×400）

3 讨论

缺血性脑卒中系由各种原因所致的局部脑组织区域血液供应障碍，导致脑组织缺血缺氧性病变坏死，进而产生临床上对应的神经功能缺失表现。本实验采取线栓法制备MCAO模型大鼠，最终使线栓阻断大脑中动脉的起始端，进而阻断大脑中动脉的血流供应，造成局灶性脑缺血模型，模拟人体大脑中动脉阻塞型脑缺血过程。研究发现，大脑缺血缺氧之后会激活缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor，HIF）和蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）表达，两种蛋白被激活后可分别诱导下游的蛋白反应，最终激活细胞的自噬功能，从而清除受损的细胞来维持正常细胞的功能，自噬和凋亡同时发生，加速细胞死亡，减小缺血半暗带的面积，进而使脑缺血后大脑皮层的梗死体积增大[12]。

本研究中，电针组7 d、14 d 的脑梗体积与模型组相比有明显的减少，且电针组在7 d、14 d 时尼氏小体数量较模型组有明显增加，损伤程度较模型组轻，尼氏小体形态也较为完整，排列较模型组密集。同时电针组神经缺损评分在7 d、14 d与模型组相比，下降幅度较大。此时在微观层面中，电针组尼氏小体增加数量也是多于模型组，形态较完整，排列较紧密，提示电针可以增加脑梗死缺血侧大脑皮层的尼氏小体数量，保持其细胞形态的完整，进而对脑梗后大鼠运动功能恢复有促进作用。内关为心包经络穴，心主神明，心包为心的护卫，代君行令，取内关穴可通窍醒神；心主血脉，取内关穴可通血脉行气血。足三里为阳明经穴、胃的下合穴，阳明经为多气多血之经，阳明经气血通畅，正气得以扶助，才能使机体功能逐渐恢复[13]。两穴相配，可起到活血化瘀，舒脑通络的作用，减轻脑梗死带来的损害，促进脑梗死后肢体功能恢复。

本次实验研究发现，电针“内关”、“足三里”可以减小MCAO大鼠梗死侧大脑皮层的梗死体积，缩短尼氏小体恢复时间，促进梗死侧大脑皮层尼氏小体数量的增加，初步证实随着梗死侧大脑皮层尼氏小体的增加，MCAO 大鼠的运动功能会逐步恢复。然而，由于本课题研究方法和指标局限，样本量不足，干预周期短，且急性脑梗死机制复杂，影响神经可塑性的因素较繁杂，不能全面的阐述电针治疗急性脑梗死的发生机制与作用。将来在人员、时间、资金较为充足的条件下，可进一步探讨如：设计样本量更大，不同电针刺激频率、不同穴位组合的比较；不同的检测指标之间的相互关系如何；观测的时间位点延长，比如延长至4 周甚或1 个月或更长等等，都可以进行深入研究探讨，以期为临床电针治疗脑梗死提供更加合理的方案和理论支持。