高效液相色谱-质谱联用法测定庆阳地产黄酒中环匹阿尼酸

徐娅茹，钱 慜，陈德阳，孙国政

（1.庆阳市食品检验检测中心 甘肃庆阳 745000；2.庆阳市疾病预防控制中心，甘肃庆阳 745000）

环匹阿尼酸（Cyclopiazonic Acid，CPA）是由甲羟戊酸、色氨酸和二醋酸酯单元生物合成的吲哚四胺酸，是曲霉属和青霉属的几种真菌次级代谢产生的一种真菌毒素[1]。黄酒是世界上最古老的酒类之一，是我国传统的发酵酒，历史悠久，文化绵长。黄酒的产地较广，品种多样，酿造原料、发酵方法以及色泽口感都具有地域特色。因地域文化差异，人们对黄酒的品鉴标准也各有倾向，但这丝毫不影响中国居民对黄酒的喜爱。黄酒既可作为烹饪料酒，也可以作为饮用酒、保健酒等。在甘肃庆阳市，黄酒酿造普及家家户户，是逢年过节餐桌上必不缺少的佳品。但是自家酿黄酒的工艺不同，缺少过程控制，容易造成杂菌污染，并产生一些有害的次级代谢产物。当前，国内尚未出台环匹阿尼酸检测标准。鉴于此，本实验采用高效液相色谱-质谱联用法，对黄酒中环匹阿尼酸进行检测，利用质谱的高选择性和高灵敏度特点，对庆阳地产黄酒品质进行初步研究，为食品安全检测行业提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黄酒，庆阳本地产，38 批次；环匹阿尼酸（Pribolab公司）；内标：U-Cyclopiazonic Acid（U-CPA）（Pribolab公司）；甲醇（色谱纯）；屈臣氏饮用水（蒸馏熟水制法）。

1260+G6460C 三重四极杆液质联用仪，美国安捷伦公司；超声波清洗仪，德国密理博公司；0.22 μm水相过滤膜、有机相过滤膜，上海安普实验科技股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备

环匹阿尼酸提取：准确吸取黄酒样品5 mL，加入U-CPA10ng，用5 mL 甲醇作提取液，振摇提取120 min，混合离心（4 000 r·min-1）5 min，用微孔过滤膜（0.22 μm）过滤后进样。

1.2.2 仪器条件

（1）液相色谱条件。色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm×3.5 μm）； 流 动 相A：0.1%甲酸水溶液；流动相B：甲醇（色谱纯）；流速：0.2 mL·min-1；柱温：35℃；进样体积：5 μL。梯 度 洗 脱（B 相）：0 min，20%；0.0 ～1.0 min，

20% →95%；1.0 ～5.0 min，95% →95%；5.0 ～5.5 min，95%→20%；5.5 ～8.0 min，20%→20%。

（2）质谱条件。电喷雾正离子模式（ESI+），多反应监测模式（MRM），载气为氮气，干燥气温度350 ℃，流量12 mL·min-1，雾化气压力35 psi[2-3]。

2 结果与分析

2.1 质谱多反应模式离子监测条件优化

分别取浓度为1 000 ng·mL-1环匹阿尼酸标准溶液和浓度为100 ng·mL-1内标物（U-CPA）标准溶液，采用多反应监测模式（MRM）进行优化。①在SIM 模式下，确定环匹阿尼酸母离子为337.2，保留时间为2.619 min；内标物母离子为357.3，保留时间为2.626 min，优化毛细管出口电压。②进行子离子扫描，使用已经优化好的参数，选择定量离子和定性离子，优化碰撞能量。③在MRM 模式下，对环匹阿尼酸和内标物进行监测。优化后的MRM 条件见表1。

表1 环匹阿尼酸和内标物的质谱参数表

2.2 色谱条件优化

采用Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm×3.5 μm）反向极性色谱柱，ZORBAX 色谱柱基于传统的全多孔填料颗粒，具有最高的载样量和分离度。实验结果表明该色谱柱对环匹阿尼酸分离度高；采用100 mm 长度进行分离，可以缩短分离时间，提高效率。分别选择了纯水-甲醇、纯水（含0.1%甲酸）-甲醇、纯水-乙腈、纯水（含0.1%甲酸）乙腈作为流动相，对比发现流动相水相中加入甲酸分离度更好，峰型良好，无明显前伸和拖尾。因此，选用含0.1%甲酸的纯水-甲醇作为流动相。环匹阿尼酸总离子流图见图1。

图1 环匹阿尼酸的总离子流图（100 ng·mL-1）

2.3 线性关系、检出限与定量限

配制浓度为1 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、40 ng·mL-1、80 ng·mL-1、100 ng·mL-1和200 ng·mL-1的8个浓度标准工作溶液。采取上述的仪器条件序列进样，用MassHunter 定量软件分析。以环匹阿尼酸浓度为横坐标，以对应的定量离子峰面积与内标物质的峰面积的比值为纵坐标，绘制标准曲线。拟合直线回归方程为y=0.593 793x+0.102 724。标准曲线的相关系数R2=0.999 5，说明线性关系良好。当环匹阿尼酸标准工作液浓度为1 ng·mL-1时，实时信噪比（S/N）为5，则以S/N=3 计算检出限为0.6 ng·mL-1，以S/N=10 计算定量限为2.0 ng·mL-1。线性关系见图2。

图2 环匹阿尼酸的线性关系图

2.4 精密度

选取浓度为80 ng·mL-1的标准工作溶液，按照上述方法连续进样6 次，进行精密度的测定。结果显示，计算得6 次数值的RSD 值为0.71%，表示精密度好。

2.5 黄酒样品的测定与回收率

对市售38 批次黄酒样品按照上述样品制备方法进行前处理，按照优化好的质谱条件参数进行环匹阿尼酸定量检测分析。其中7 批次样品有检出，5 批次样品检出值在定量限以上。具体含量见表2。

表2 黄酒样品中环匹阿尼酸含量表

取同一空白黄酒样品，分别向其中添加10 ng·mL-1、50 ng·mL-1、120 ng·mL-1不同浓度的环匹阿尼酸标准溶液，做3个水平的添加回收，根据实际测得值计算回收率在99.7%～110.3%。

3 结论

本实验采用高效液相色谱-质谱联用对黄酒中环匹阿尼氨酸进行检测，该方法线性关系好，精密度高，回收率在99.7%～110.3%，检出限和定量限低，灵敏度高，重现性好；样品前处理采用甲醇提取的方法，简便快速高效，省略了烦琐的前处理步骤，减少环节损失，提高了准确度。该方法可用于我国对黄酒产品的检测分析和质量控制。

庆阳黄酒以黄米为主要原料，小麦制曲，采用边糖化边发酵的开放式发酵工艺，在发酵过程中容易受到杂菌污染，微生物繁殖代谢会产生有毒的次级代谢产物-环匹阿尼酸。环匹阿尼酸与黄曲霉毒素经常在相似的条件下被同时发现，由此可知，如果酿造原料受到黄曲霉毒素污染，那么很大程度上会检测出环匹阿尼酸[4]。此次实验，通过对38 批次不同来源的庆阳市地产黄酒进行检测分析，发现有约18%的黄酒在生产过程中产生了微量的环匹阿尼酸。有实验证明环匹阿尼酸会导致大鼠的肝、胰、脾、肾、唾液腺、心肌和骨骼肌产生退化性变化及坏死[5]。因此，对黄酒中的环匹阿尼酸检测和控制很有必要，建议庆阳黄酒在生产中从原料选用到酿造、包装、运输过程中环环控制，步步监测，减少污染的概率，切实提高黄酒产品品质，发扬庆阳黄酒文化，打造庆阳黄酒知名品牌。