高效液相色谱法测蜂蜜中的4种水溶性糖

彭礼枚，谭丽君

（1.广电计量检测（湖南）有限公司，湖南长沙 410000；2.中国电建集团中南勘测研究院有限公司，湖南长沙 410000）

目前，测定蜂蜜中的水溶性糖的方法主要有高效液相色谱法[1-3]（检测器主要有示差折光检测器和蒸发光散射检测器等）、化学法和离子色谱法[4-6]等。本文采用高效液相色谱法示差折光检测器检测蜂蜜中的4种可溶性糖，该方法具有简单、准确等优点。

1 材料与方法

1.1 材料

蜂蜜样品，市售。

1.2 仪器和试剂

HP-1200 高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；HY-5 回旋式振荡器（江苏金域国胜实验仪器厂）；分析天平（Sartourius CP224S，Max=220 g，d=0.1 mg）；

乙腈（MERCK KGaA）、果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖标准品（均为色谱纯）。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液的配制

用分析天平准确称取1.000 0 g 果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖标准品于烧杯中，用去离子水溶解，全被转移至1 000 mL 容量瓶中，用去离子水定容到刻度，配制成1 000.0 mg·L-1的标准储备液。用移液管移取10.00 mL 标准储备液至100 mL 容量瓶中，配制成100.0 mg·L-1的标准使用液，分别移取0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL 和1.00 mL的标准使用液于10.0 mL 容量瓶中，用去离子水定容，配制成质量浓度分别为0. 5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、2.0 mg·L-1、5.0 mg·L-1和10.0 mg·L-1系列标准溶液。

1.3.2 色谱条件

液相色谱仪：安捷伦1200；色谱柱：Waters XBridgeTM Amide 柱，膜厚3.5 µm，内径4.6 mm，长250 mm；流动相：70%乙腈水溶液（等度洗脱15 min）；流速：0.8 mL·min-1；柱温：85 ℃；检测器：示差折光检测器（35 ℃）。

1.3.3 样品处理

准确称取样品0.250 0 g 于50 mL 锥形瓶中，加入20 mL 乙腈水萃取溶液（1 ∶1），振荡器上振荡40 min，取上清液到离心管，以2 000 r·min-1离心20 min，取上层清液，用0.45 µm 微孔滤膜过滤到色谱瓶，进样。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的确定

2.1.1 流动相选择

用乙腈和水二元流动相在线混合，色谱基线波动较大，这与示差折光检测器对流动相密度、温度变化比较敏感，而液相色谱泵无法使两种流动相在线即时充分混合均匀有关。因此，使用预混合好的乙腈水溶液，色谱基线稳定。同时，本实验也分别考察了不同比例（4 ∶6、5 ∶5、6 ∶4、7 ∶3 和8 ∶2）乙腈水溶液（体积比）作为流动相的情况。结果发现，乙腈在流动相中的比例增大，可有效改善色谱峰形，有利于各组分的基线分离，但乙腈比例增加不利于糖的溶解，分析时间也显著延长。当增加流动相中水的比例时，分析时间变短。但水的比例过大，组分峰相互靠近，特别是果糖与葡萄糖不能很好地分离。因此，综合考虑分离效果、分析时间等因素，本实验选择乙腈-水（7 ∶3，V∶V）作为流动相。

2.1.2 柱温选择

本文考察了不同柱温(35 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃、75 ℃和85 ℃)下混合糖溶液的分离效果。结果发现，在低温时（35 ℃，45 ℃），葡萄糖和果糖峰形不能分开，且麦芽糖的峰形拖尾。随着温度的升高，麦芽糖峰形拖尾现象改善，葡萄糖和果糖也能很好地分开，出峰时间也明显缩短。因此，选择85 ℃的柱温为实验最佳柱温。

2.1.3 流动相流速的选择

本文考察了不同流动相流速（0.5 mL·min-1、0.6 mL·min-1、0.7 mL·min-1、0.8 mL·min-1、0.9 mL·min-1和1.0 mL·min-1）对样品分离效果的影响。结果表明，流速为0.9 mL·min-1和1.0 mL·min-1时，柱 压 过 高；流 速 为0.5 mL·min-1、0.6 mL·min-1和0.7 mL·min-1时，样品中的糖不能很好地分离，且分离时间也较长。在流速为0.8 mL·min-1时，样品能够很好地分离，且分离时间短。因此，选择流动相流速为0.8 mL·min-1。

2.2 前处理条件的选择

2.2.1 超声提取和振动提取的对比

为选择适宜的提取方式，在其他条件不变的情况，对蜂蜜样品进行了超声和振荡提取实验，提取时间为40 min。由表1 可知，两种方法提取的糖量相当。由于超声提取噪声污染大，故本实验采用振荡提取。

表1 超声提取和振荡提取的糖量表（单位：%）

2.2.2 萃取时间的确定

实验考察了不同振荡提取时间（10 min、20 min、30 min、40 min 和50 min）对水溶性糖含量的影响。由图1 可知，提取时间在10 ～40 min 时，水溶性糖含量逐渐增加，在提取时间为40 min 时达到最大值，当提取时间为50 min 时水溶性糖含量反而降低，所以选择40 min 为最佳的提取时间。

图1 不同萃取时间提取的水溶性糖含量图

2.2.3 萃取溶剂的选择

大多数研究均选用水作为糖的萃取溶剂。为选择适宜的萃取溶剂，实验分别用100%水、50%乙腈水溶液、60%乙腈水溶液、70%乙腈水溶液和80%的乙腈水溶液作为萃取溶剂对果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖等4种水溶性糖标样进行溶解与色谱分离实验。由图2 可知，用水溶解这4种糖标样时，其色谱峰分离度差，峰形变宽且有拐点；用60%乙腈水溶液、70%乙腈水溶液和80%乙腈水溶液作为萃取溶剂时，水溶性糖溶解度降低；用50%乙腈水溶液作为萃取溶剂，4种糖的溶解均较好，而且在选定的液相条件下，色谱峰分离好，同时在50%乙腈作为萃取溶剂时，水溶性糖的含量最高，因此用50%乙腈水溶液作为萃取溶剂。

图2 不同比例的萃取溶剂对水溶性糖提取量的影响

2.3 蜂蜜中可溶性糖含量的测定

由表2 可知，1 号样品的总糖含量最高，达84.62%；3 号样品次之，达81.75%；2 号样品最低，达79.72%；蜂蜜中主要含有果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖4种水溶性糖，其中果糖含量均为最高；RSD均在5%以下，实验重复性好。

表2 蜂蜜中各单糖含量表（单位：%）

2.4 标准曲线及检出限

取上述标准使用液，分别配制成一系列的标准溶液，在1.3.2 的实验条件下，以峰面积为纵坐标、质量浓度为横坐标绘制工作曲线，线性方程、相关系数见表3。以空白3 倍信噪比计算出各目标化合物的检出限，以3 倍检出限确定方法的定量限。由表3可知，4种目标化合物的检出限为0.04 ～0.28 mg·L-1。

表3 标准曲线的线性方程和相关系数以及检出限表

2.5 方法的回收率

按1.3.2 实验方法在空白样品中进行加标回收实验，每个水平重复5 次，回收率和测定值的相对标准偏差结果见表4。由表4 可知，果糖、葡萄糖、麦芽糖和蔗糖的回收率均高于99%，表明本方法比较准确。

表4 方法的回收率表

3 结论

本方法重复性好，回收率高，样品前处理简单，可在短时间内处理大批量的样品，适合大量蜂蜜中的葡萄糖、果糖、蔗糖和麦芽糖的测定。