托里透脓汤对肉芽肿小叶性乳腺炎caspase-1/GSDMD信号通路的影响

赵泽 左禧萌 汪唐顺 刘洁丽 杨臻瑞 高爽 孙萍 冯雪 王玉坤 史晓光

肉芽肿小叶性乳腺炎为一种发病原因不明的乳腺良性疾病，其主要临床表现为突发的乳房红肿热痛、迅速破溃流脓，形成窦道，且反复迁延不愈，难以治疗。这种疾病的病理临床表现主要为以乳腺小叶为中心的非干酪样坏死，主要病理变化为生成肉芽肿病灶[1]。该疾病的主要治疗方式目前为激素[2]治疗、免疫抑制剂[3]治疗及手术[4]治疗等，但疗效参差不齐且均存在一定副作用，寻找更为合适的治疗方式仍为研究重点。中医药尽管作用时间相较糖皮质激素及手术治疗更长，且具有副作用小、减少乳房损毁等优点，但针对肉芽肿小叶性乳腺炎的中医理论繁多[5-7]，且药物各异。因此，从现有中医药中筛选合适的药物参与对肉芽肿小叶性乳腺炎的治疗仍具有必要性。

托里透脓汤出自《医宗金鉴》卷六十三，为托毒溃脓之剂，主治正虚不能托毒、内已成脓、外不易溃、漫肿无头之痈疡，为外科托法中的著名方剂。由补益气血和透脓的药物组成，在既往研究中被广泛应用于难治性褥疮[8]、肛周脓肿[9]、坐骨直肠窝脓肿[10]等难治性疮疡上。考虑到该病临床表现符合托里透脓汤适用证型，且在既往临床肉芽肿小叶性乳腺炎治疗中有一定疗效[11]，本研究拟通过动物实验进一步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雌性SD大鼠20只，体质量350～450 g，周龄不限，有孕产史，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，常规饲养。本实验经北京中医药大学东直门医院动物伦理委员会审批许可，伦理号：20-48。

1.2 药物与试剂

托里透脓汤，处方：人参10 g、白术10 g、王不留行15 g、白芷10 g、升麻10 g、甘草 6 g、当归10 g、黄芪15 g、皂角刺10 g、醋青皮6 g。以上中药采用北京康仁堂药业有限公司制备的配方颗粒剂型。

完全弗氏佐剂(sigma，美国)，IL-18酶联免疫吸附测定(ezyme linted immunosorbent assay, elisa)试剂盒(proteintech，中国)，caspase-1兔一抗、GSDMD兔一抗、IL-18兔一抗、IL-1β兔一抗、a-tublin兔一抗、山羊抗兔IgG(H+L)(SA00001-2，proteintech，中国)，蛋白酶抑制剂cocktail、RIPA细胞裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、5×loading buffer(索莱宝，中国)，10 %SDS-PAGE凝胶试剂盒(雅酶，中国)。

1.3 造模与分组

参照《肉芽肿小叶性乳腺炎动物模型初探讨》中方式构建动物模型：将人肉芽肿小叶性乳腺炎标本组织称重、人工研磨至无明显大颗粒，置于于冰上，与生理盐水比例为1∶3进行超声匀浆。匀浆12000 r/min离心，取上清液与完全弗氏佐剂按1∶1体积乳化备用[12]。3%戊巴比妥溶液，30 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠。麻醉后固定于木板上，第3、4对乳房剔除毛发，用75%酒精消毒皮肤。镊子提起乳头，用接种注射器，将制备好的油包乳混悬液、生理盐水各0.2 mL分组沿乳头注入大鼠第3对、4对乳腺内，即可完成人工种植包埋过程。次日进入给药流程。

空白组、模型组、西药组(糖皮质激素组)、托里透脓汤组，每组各五只。除空白组外，其余大鼠均进行肉芽肿小叶性乳腺炎造模。

1.4 给药剂量

造模完成后第二日开始给药流程。托里透脓汤用量按人鼠体表面积换算为成人一日剂量的6倍，蒸馏水配制为终浓度10 mg/mL，灌胃2 mL，每日一次；西药即醋酸泼尼松，按人鼠体表面积换算为10 mg/kg灌胃，每日一次；模型组及空白组灌服等量蒸馏水，每日一次。给药21日后取材。

1.5 观察指标

1.5.1 组织病理学检测 颈椎脱臼处死所有大鼠，将大鼠第3、4对乳腺组织及乳腺周围皮肤剥离，取其中1个乳腺福尔马林溶液固定。常规脱水、石蜡包埋、切片厚度为4 μm，运用HE染色及雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progesterone receptor，PR)免疫组化染色。

1.5.2 炎症因子检测 腹主动脉取血常温凝血15分钟，3000 r/分钟，离心15分钟，取上层血清。Elisa法进行白细胞介素(interleukin，IL)-18检测。

1.5.3 组织匀浆检测 组织称重后加入含蛋白酶抑制剂cocktail的RIPA裂解液，组织∶裂解液=1∶10，剪碎至无明显大颗粒，超声仪超声10秒，冰上裂解30分钟。12000 r/分钟离心裂解液收集上清，BCA法蛋白定量后将蛋白浓度调至5 μg/uL，加5× loading buffer，沸水煮10分钟。SDS-PAGE凝胶电泳(100 V，1小时30分钟)，每泳道上样50 μg，转膜至NC膜(200 mA，1小时30分钟)。5%脱脂牛奶室温封闭1小时，一抗4℃孵育过夜，浓度：IL-18(1∶1 000)、IL-1β(1∶1 000)、半胱胺蛋白酶-1(caspase-1，1∶1 000)、消皮素-D(Gasdermin-D，GSDMD，1∶1 0000)。隔日室温下二抗(1∶10 000)，孵育1小时，用 Image QuantTmlAS-4000Mini Imager摄图，ImageJ 180量化。

1.5.4 其他一般指标检测 使用游标卡尺测量大鼠第3对、第4对乳腺直径，并测量大鼠体重，每日一次。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 托里透脓汤对肉芽肿小叶性乳腺炎大鼠一般体征的影响

给药第21天，与空白组比较，肉芽肿小叶性乳腺炎模型组的乳腺直径显著增加(P<0.001)，体质量无明显变化，提示肉芽肿小叶性乳腺炎使乳腺组织总体积增加；与模型组相比，西药组及托里透脓汤组乳腺直径显著减小(P<0.001)，西药组体质量无明显变化，托里透脓汤组体质量明显增加(P<0.01)，具体见表1～2。

表1 不同时间糖皮质激素及托里透脓汤对肉芽肿小叶性乳腺炎大鼠乳腺直径的影响

2.2 托里透脓汤对肉芽肿小叶性乳腺炎大鼠乳腺组织病理学的影响

空白组乳腺小叶结构清晰，组织结构层次完整，可见乳腺大导管的上皮样增生，未见明显炎性细胞浸润及其他改变；模型组可见大量嗜酸性粒细胞、淋巴细胞及浆细胞浸润，导管内大量物质潴留，乳腺小叶结构消失，伴脓肿形成及大量脂质空泡，边界不清；西药组可见乳腺小叶结构存在，炎细胞浸润不明显；托里透脓汤组可见脓肿边界清晰，脓肿内主要成分为多核巨细胞，脓肿外较模型组炎症细胞浸润较少。见图1。

注：A空白组，B模型组，C西药组，D托里透脓汤组。

2.3 托里透脓汤对肉芽肿小叶性乳腺炎大鼠乳腺组织ER、PR表达的影响

与模型组相比，空白组、西药组、托里透脓汤组相较模型组乳腺组织的ER表达增加，棕黄色阳性染色面积更高，其主要原因为完整乳腺组织量的不同；空白组、托里透脓汤组相较模型组PR表达增加，棕黄色阳性染色面积更高。见表3、图2。

表2 不同时间糖皮质激素及托里透脓汤对肉芽肿小叶性乳腺炎大鼠体重的影响

表3 各组肉芽肿小叶性乳腺炎大鼠ER、PR面积阳性占比的比较

注：A空白组阴性对照，B空白组ER，C空白组PR；D模型组阴性对照，E模型组ER，F模型组PR；H西药组阴性对照，I西药组ER，J西药组PR；K托里透脓汤组阴性对照，L托里透脓汤组ER，M托里透脓汤组PR。

2.4 托里透脓汤对肉芽肿小叶性乳腺炎大鼠炎性因子及细胞焦亡相关性指标的影响

与模型组比较，西药组及托里透脓汤组血清IL-18含量降低，且差异有统计学意义(P<0.05)，见表4；组织匀浆中caspase-1、GSDMD-n、IL-1β、cleaved IL-1β蛋白表达水平显著降低，且差异有统计学意义(P<0.05)，见表5、图4。

注：A空白对照组；B模型组；C西药组；D托里透脓汤组。

表4 各组肉芽肿小叶性乳腺炎大鼠血清IL-18含量的比较

表5 托里透脓汤对肉芽肿小叶性乳腺炎大鼠细胞焦亡相关指标的影响

3 讨论

课题组经网络药理学分析，认为托里透脓汤治疗肉芽肿小叶性乳腺炎的关键成分主要为黄酮类化合物槲皮素、山奈酚、芒柄花素、柚皮素、异鼠李素，人参皂苷类化合物人参皂苷Rh2与芍药苷等[13]；且认为其主要作用靶点为IL-1β、IL-6、TNF、CCL2、CXCL8，主要作用为抑制细胞因子及细胞因子受体的作用、抗炎作用、类激素作用及免疫调节作用。本实验结果显示托里透脓汤能使肉芽肿小叶性乳腺炎大鼠的病灶局限化、降低血清中IL-18水平及组织IL-1β水平，增加乳腺组织局部ER及PR的表达，体现其类激素作用及抗炎作用。caspase-1/GSDMD信号通路为细胞焦亡的典型信号通路，其主要过程为活化的caspase-1切割GSDMD，形成含有Gasdermin D氮端活性域的肽段即GSDMD-n，使细胞膜穿孔水解，进而导致细胞破裂，释放细胞内内容物导致炎症反应[14]；除此之外，活化的caspase-1切割IL-1β及IL-18并释放到胞外，募集炎症细胞聚集，使炎症反应迅速扩大。该信号通路临床表现主要为迅速扩散的炎症反应，符合肉芽肿小叶性乳腺炎突发乳房肿块、迅速红肿破溃的临床表现。当GSDMD的水解降低，即GSDMD-n的表达降低时，细胞焦亡受到一定程度限制，但不影响IL-18及IL-1β的表达[14]。在本研究中，糖皮质激素与托里透脓汤均可降低GSDMD-n的表达，因而可以认为，糖皮质激素与托里透脓汤在传统抗炎作用之上，具有一定程度抑制肉芽肿小叶性乳腺炎组织内细胞焦亡的可能。在既往研究中，雌激素可以通过改变线粒体功能与减轻炎症相关的细胞焦亡信号通路降低组织损伤[16]，同样符合托里透脓汤的类激素作用及抗炎效果推测。

综上所述，caspase-1/GSDMD信号通路可能在肉芽肿小叶性乳腺炎中存在异常表达现象，其主要诱导因素可能为乳腺导管内某种抗原诱发的炎症因子风暴。托里透脓汤的主要作用机制为通过下调IL-1β及IL-18、caspase-1、GSDMD等细胞焦亡信号通路相关的炎症因子以达到中止细胞焦亡在乳腺组织中诱发的连锁反应，并使炎症反应局限在局部，达到托里透脓、加快康复的目的。本实验的不足为：尚未对托里透脓汤给药浓度进行进一步研究，且需进一步探讨该药物对趋化因子的影响。