升降通癃方中空栓对前列腺增生大鼠模型的影响

胡黄金 雷利娟 郑靓怡 杨妮 赵鹏 孟春慧 孟婼娅 张恒

良性前列腺增生 (benign prostate hyperplasin, BPH)又称前列腺肥大，是中老年男性最常见的疾病之一，由于其腺体上皮和间质的增生，并发症包括急性尿潴留和尿路梗阻等[1]。随着中国老龄化的到来和年龄的增长，BPH的发病率逐年上升，而且越来越年轻化[2]。雄激素是引起 BPH的性激素己被学者认同，但不是唯一的，雌激素也发挥着作用，此外雌、雄激素平衡失调的也是重要因素[3]，且与新血管生成密切相关，这些可能是导致 BPH 的重要机制。而使用天然中医药治疗BPH悠久，中药复方能明显改善相应症状[4-5]。

中空栓剂是 1984 年始于日本学者在普通栓剂的基础上发展起来的新型栓型，其栓壳为基质，中空部可填充药物，较普通栓剂释药快、起效快、生物利用度高、药物稳定、且其给药操作简易等优点。“升降通癃方”为山西省中医药研究院治疗BPH总结出治疗BPH疗效颇佳的经验方。临床应用10余年，具有疗效好，副作用少，费用低的优势，对于生活行为能力差或患有胃肠道疾的老年人、不便于服用中药汤剂或对服用免煎颗粒服用口感不适应的患者，研制出高效、简便、无毒副作用的中药新剂型，加以推广应用具有重要的理论及实用价值。所以本实验，将报道升降通隆方中空栓对大鼠BPH模型的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

70只性成熟雄性SD大鼠，SPF级，体重210±10 g，购于北京华阜康生物科技股份有限公司动物(许可证号为:SCXX(京)2019-008)，于山西省中医药研究院动物实验中心的动物房饲养。

1.2 药品、试剂与仪器

升降通癃方颗粒剂：熟地黄20 g、山药10 g、酒萸肉12 g、酒苁蓉10 g、益母草15 g、醋三棱10 g、炒王不留行10 g、夏枯草10 g、黄芪10 g、泽泻10 g、升麻12 g、牛膝10 g、黄柏8 g、盐车前子15 g、甘草6 g。每剂药总质量为25.5 g，购于山西省中医药研究院颗粒剂处，江阴天江药业；丙酸睾酮注射液(杭州动物药品厂，兽药字(110201054)；橄榄油[艾贝克有限公司(西班牙)843701604333]；注射用青霉素钠(瑞阳制药有限公司，国字准号：H37021950)；液体石蜡(天津市致远化学试剂有限公司)；睾酮(testosterone,T)；酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒(货号：ml002868)、雌二醇(estradiol,E2)ELISA试剂盒(货号：ml002871)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)ELISA试剂盒(货号：ml002868)均购于上海酶联生物科技有限公司

Synergy H1多功能微孔读板机酶标仪：美国 Bio Tek公司；KDC-1044低速冷冻离心机：科大创新股份有限公司中佳分公司；BP211D电子天平：德国赛多利斯公司； TKY-BMB石蜡包埋机：湖北康泰医疗设备有限公司； F325旋转石蜡切片机：美国 Thermo 公司； BX43光学显微镜：日本OLYMPUS。

1.3 中空栓制备和升降通癃方水溶液

空白中空栓制备[6]：将混合脂肪酸甘油酯装入烧杯中置于恒温水箱中加热至40℃融化，灌入已加热至40℃涂有润滑剂的栓模中，冷却成型，栓腔内仅加入 1，2丙二醇，封底，刮削，启模，得空白中空栓。升降通癃方中剂量中空栓：制备过程与空白中空栓相同，仅将1，2丙二醇换成升降通癃方药液(1，2丙二醇为溶媒按1 mL∶1 g)，制成升降通癃方中剂量中空栓，平均每粒重2.902 g，体积2.5 mL，呈鱼雷型，每粒含药量为0.59 g，大鼠给药浓度为1.99 g/kg。升降通癃方高剂量中空栓为2粒升降通癃方中剂量中空栓，总含药量为1.18 g，大鼠给药浓度为3.98 g/kg。升降通癃方低剂量中空栓，每粒含生药量为0.29 g，大鼠给药浓度为0.99 g/kg。非那雄胺中空栓：制备过程与空白中空栓相同，仅将1，2丙二醇换成非那雄胺药液1，2丙二醇为溶媒配成浓度为0.34 mg/mL的非那雄胺悬浮液，每粒含生药量为0.13 mg，大鼠给药浓度为0.45 mg/kg；升降通癃方水溶液：将升降通癃方颗粒剂打粉后融于水中，制成浓度为0.19 g/mL的溶液，大鼠给药浓度为1.99 g/kg，于冰箱中冷藏备用。

1.4 模型制备

模型制备[7]： 除假手术组大鼠仅行假手术切开阴囊暴露睾丸于空气中10分钟再缝合外， 其余造模组大鼠， 腹腔注射10%的水合氯醛(0.35 mL/100 g)麻醉，经阴囊切除双侧睾丸。术后青霉素抗感染7天，于第8天，造模组经背、侧腹部皮下多个注射部位交替注射浓度为5 mg·kg-1·d-1丙酸睾酮，规格1 mL∶25 m g(按1∶4溶于无菌橄榄油)，即给药体积为0.1 mL /100 g，根据每周四上午所称体重，每周调整一次丙酸睾酮剂量，假手术对照组大鼠仅背部皮下注射无菌橄榄油按0.1 mL/100 g，均连续注射28天。

1.5 实验分组及给药

适应性喂养7天，采用随机数表法，将70只大鼠分组为：假手术对照组(假手术组)、模型组、非那雄胺阳性组(阳性组)、升降通癃方中空栓组高剂量(高剂量组)、升降通癃方中空栓中剂量组(中剂量组)、升降通癃方中空栓低剂量组(低剂量组)，升降通隆方溶液灌胃给药组(灌胃组)，每组10只，用3%三硝基苯酚溶液进行染色标记。于术后第8天，假手术组、模型组大鼠通过肛塞直肠给与空白中空栓纳肛直肠给药，阳性组、高、中、低剂量组大鼠分别给与相应中空栓纳肛直肠给药，并按住肛门5分钟，待中空栓栓壳融化释放药液，灌胃组大鼠给与3 mL升降通癃方水溶液灌胃给药，即给药量等于升降通癃方中剂量中空栓的含药量，所有大鼠连续给药28天。

1.6 测量大鼠前列腺湿重及计算前列腺指数

杀检前天晚上禁食不禁水12小时，早上称量大鼠空腹体质量，末次给药1小时后，腹腔注射麻醉，使用5 mL无菌注射器腹主动脉取血，然后分离前列腺组织，用9%生理盐水洗净、剥离附着的组织和血液，用滤纸吸去多余的水分，再用电子称测量前列腺湿重，计算前列腺指数=前列腺湿质量/大鼠体质量。取部分大鼠前列腺组织放入预先备好的 4% 多聚甲醛固定液中，为病理切片准备，剩余置于液氮中保存。

1.7 酶联免疫吸附法检测

腹主动脉取血，室温静置1小时后3 500 rpm 离心，15分钟，取上层血清。采用竞争技术，操作严格按照试剂盒说明书进行测定样品中大鼠血清E2、T、VEGF的水平。取前列腺400 mg，于冰块上匀浆，以3000 r/min离心30分钟，取上清液，严格按照试剂盒说明书酶免法测定前列腺组织中E2、T、VEGF的水平。

1.8 HE染色

取4%多聚甲醛已固定好的前列腺组织, 常规石蜡包埋, 切片脱腊至水,光学显微镜下观察各组前列腺组织病理结构的变化，保存病理图片。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠前列腺湿质量及前列腺指数比较

与假手术组比，模型组大鼠前列腺湿质量与指数均明显上升(P<0.05)；与模型组比，阳性组与高剂量组大鼠前列腺湿质量与指数均明显下降(P<0.05)，中剂量组与灌胃组大鼠前列腺体指数下降(P<0.05)；与低剂量组比，高剂量组大鼠前列腺湿质量与指数均明显下降(P<0.05)；与灌胃组比，大鼠前列腺质量与指数差异影响不明显。见表1。

表1 各组大鼠前列腺湿质量、指数及密度的比较

2.2 各组大鼠前列腺中T、E2、VEGF的水平

与假手术组比，模型组大鼠前列腺T水平明显下降(P<0.05)，E2与VEGF水平明显上升(P<0.05)；与模型组比，各给药组大鼠前列腺T水平明显上升(P<0.05)，E2与VEGF水平明显下降(P<0.05)；与低剂量组比，高剂量组与中剂量组大鼠前列腺T水平明显上升(P<0.05)，E2水平明显下降(P<0.05)；与灌胃组比，中剂量组大鼠前列腺E2的水平明显下降(P<0.05)，T与VEGF的水平差异影响不明显(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠前列腺中T、E2、VEGF水平的比较

2.3 各组大鼠血清中T、E2、VEGF的水平

与假手术组比，模型组大鼠血清中T水平明显下降(P<0.05)，E2与VEGF水平明显上升(P<0.05)；与模型组比，各给药组大鼠血清中T水平明显上升(P<0.05)，E2与VEGF水平明显下降(P<0.05)；与低剂量组比，高剂量组大鼠血清中T水平明显上升(P<0.05)，VEGF水平明显下降(P<0.05)；与灌胃组比，中剂量组大鼠中T、E2与VEGF的水平差异影响不明显(P>0.05)。见表3。

表3 各组大鼠血清中T、E2、VEGF水平的比较

2.4 升降通隆方对大鼠前列腺组织病理变化

高倍镜(HE，400×)下各组前列腺组织病理结构观察可见：假手术组大鼠前列腺上皮细胞均匀整齐、形态较一致，间质无纤维结缔组织增生，形态结构正常；模型组前列腺腔内缩小，内见明显粉色浓染均质状物，腺上皮细胞有明显的增生褶皱，有乳头状的结构，间质可见明显纤维结缔组织增生；阳性组前列腺上皮细胞形态结构恢复正常，间质无纤维结缔组织增生；高剂量组前列腺上皮细胞有少量增生，形态结构基本恢复正常；中剂量组前列腺上皮细胞较厚，且有轻微增生褶皱和乳头状的结构；低剂量组前列腺上皮细胞有明显的增生褶皱，内见较多粉色浓染均质状物，形态异常；灌胃组前列腺上皮细胞有明显的乳头状的结构；结果表明，升降通隆方对增生的前列腺具有一定的抑制作用，各组间前列腺组织病理学改变比较有意义。

注：A 假手术组；B 模型组；C 阳性组；D高剂量组；E中剂量组；F低剂量组；G灌胃组。

3 讨论

BPH属于中医学“癃闭”，该病名首见于《内经》，之后有闭癃、淋闭之称[8]。《素问·上古天真论》曰: “丈夫八岁……天癸竭，精少，肾脏衰，形体皆极。”肾与膀胱相表里。《素问·灵兰秘典论篇》曰：“膀胱者，州都之官，津液藏焉，气化则能出矣。” 多数临床中医认为BPH基本病机是肾虚血瘀，虚实夹杂证[9-10]。升降通隆方中以熟地、益母草为君药，熟地益精髓，滋肾精，益母草活血利水，善祛膀胱之瘀。山药补脾肾，即补肾固精，又补脾助后天之本；山茱萸补肝肾，肉苁蓉补肾阳、益精血，药力和缓，补阳不燥，补阴不腻，能润肠通便，从而改善直肠对尿道的压迫，三者同为臣药；莪术行气活血，夏枯草消癥散结，王不留行走厥阴经络，消肿散瘀，通利关窍；气化则水出矣，中气不足，溲便为之变，气之不化水液不行，故加入黄芪，升麻，旨在升气补中，助阳化气；泽泻利湿泻浊，下走膀胱以利水，又能防止滋腻太过。牛膝活血能引药下行，且使药物直达病所，四药升降相宜，恢复气机升降；前列腺增生合并前列腺炎时往往以湿热为标，故加黄柏、车前子清利下焦湿热、化浊通淋，均为佐药；生甘草调和诸药，为佐使药。诸药合用，既重视扶助肾之阴阳亏损、补中益气、升清降浊、又清利湿热、活血逐瘀、消癥散结。现代药理研究发现，益母草中益母草碱可显著降低BPH前列腺中T及DHT水平[11]；王不留行有抑制新生血管增生之效[12]；黄芪能缓解尿路的不适症状[13]。前列腺与直肠解剖位置的血液供应密切联系，使得升降通隆方中空栓纳肛直肠给药可直接作用于前列腺组织，用最小的药量发挥最大程度的药效。

本实验采用去势皮下注射外源性丙酸睾丸酮复制BPH的造模方法， 排除自身雄激素的影响，可重复高。BPH 的研究普遍认为与性激素学说、生长因子学说以及凋亡与基因调控学说等密切相关[14-15]。性激素学说被普遍认可，前列腺是雄激素依赖性器官，雄激素是引发 BPH 的关键激素，其中最主要是T[16]，同时E2也发挥重要作用。陈其华等[17]实验证明，益肾通癃胶囊可通过降低T、E2水平，抑制前列腺组织增生。BPH 还涉及新血管生成，VEGF在新血管生成与 BPH的发生密切相关[18-19]，VEGF也可在E2作用下由上皮细胞释放一种促血管生成因子，可以促进间质组织中的血管生成和细胞增殖，导致BPH[20]。所以VEGF能直接促进前列腺细胞增殖，雌雄激素起间接作用。通过前列腺湿质量、指数和病理观察比较，可直接反应前列腺增生情况，通过T、E2、VEGF的水平差异的变化，能为升降通隆方中空栓的疗效提供实验数据依据。

实验显示，光镜显微镜下升降通隆方中空栓可有效缓解前列腺增生，实验中升降通隆方中空栓可明显降低BPH大鼠的前列腺湿质量及前列腺指数, 升高大鼠前列腺和血清中T水平及降低大鼠前列腺和血清E2与VEGF水平。提示，升降通隆方通过升高T水平及降低E2与VEGF水平，可能是其改善前列腺增生的一条途径；与低剂量组比，高剂量组大鼠在光镜显微镜下前列腺增生增生程度明显减轻、大鼠前列腺湿质量与指数均明显下降(P<0.05)、大鼠前列腺和血清中T水平明显上升(P<0.05)、E2水平明显下降(P<0.05)、中剂量组大鼠前列腺T水平明显上升(P<0.05)，提示，升降通隆方中空栓纳肛直肠给药疗效具有一定药效关系，且高剂量组疗效最佳；表中升降通隆方中空栓各组有无统计学意义不一致，与实验中大鼠采用纳肛直肠给药方式易刺激肛门导致大鼠将药排出，以确保直肠吸收的药量与实际给药量有关；与灌胃组比，中剂量组大鼠前列腺质量与指数差异影响不明显(P>0.05)、大鼠前列腺和血清中T、VEGF水平水平差异影响不明显(P>0.05)，但大鼠前列腺E2的水平明显下降(P<0.05)，提示升降通隆方中空栓纳肛直肠给药较升降通隆方溶液灌胃给药疗效相近，甚至更佳。

升降通隆方临床以汤剂使用，但由于剂型的局限性，药物稳定性差，服用不便。中药中空栓使药物包裹在中空栓壳内，既减少氧化潮解，同时也避免药物与基质产生硬度效应，可使释药速度减慢，与普通栓剂相比，中空栓在人体肠道环境中迅速裂解，提高了生物利用度，纳肛直肠给药方式，可使药物少受胃肠道pH值或酶的影响，通过直肠直接吸收可避免肝脏的首过效应。因此，将升降通癃方采用现代中药提取、纯化技术，制成一种既可以减少患者用药量、又能保证治疗效果、作用确切的中空栓，且使用方便、疗效快捷，为中医药治疗BPH提供新的思路及方法。

本研究有一定局限性，检测范围仅局限于T、E2、VEGF 三个因子。可进一步检测前列腺组织的PI3K/Akt信号通路、caspase-3、抗凋亡基因 Bcl-2、Bax等基因的调控，更深层次的明确升降通隆方对改善大鼠前列腺增生的分子生物学机制。

综上所述，升降通隆方中空栓通过升高大鼠前列腺增生腺体组织和血清中T水平及降低E2与VEGF水平表达水平，进而减轻前列腺湿质量，降低前列腺指数，从而达到治疗 BPH 的效果。此外升降通隆方中空栓纳肛直肠给药较升降通隆方溶液灌胃给药疗效相近，甚至更佳，创新了传统中医药治疗BPH的给药方式，为BPH患者提供了一种疗效肯定，使用简便的新剂型，将传统中药与科学技术相结合，突破中药现代化瓶颈，推动中医药事业发展，具有十分现实的意义。