lncRNA OIP5-AS1 通过海绵吸附miR-143-3p调控COL1A1 促进胃癌发展

刘 锐 褚伟伟 余明军 王海明

胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率都很高，尤其在东亚国家如中国、日本、韩国等。胃癌的发生是一个多阶段、多因素、多因子的病理过程，由基因的表达突变和表观遗传改变所致[1]。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是癌症生物学的关键调控因子，可以在多个层面调控癌症相关基因表达水平，参与胃癌的发生发展[2]，但确切机制尚不清楚。lncRNA Opa 相互作用蛋白5 反义RNA 1（Opa-interacting protein 5 antisense RNA 1，OIP5-AS1）是位于人类OIP5 基因反义链上的lncRNA，通过不同的途径促进癌症的发生发展[3]。相关研究表明，lncRNA OIP5-AS1 与miR-143-3p 在肿瘤发展中起到重要作用[4-8]。然而，其在胃癌中的具体作用和机制尚未阐明。因此，本研究将探讨lncRNA OIP5-AS1 通过靶向调控miR-143-3p 对胃癌细胞发展的影响。

1 实验材料

1.1 细 胞 胃癌细胞AGS（目录号TCHu232）购自中国科学院细胞库，SGC7901（目录号CL-0206）、MKN-45（目录号CL-0292）、BGC823（目录号CL-0033）及人正常胃细胞GES-1（目录号CL-0563）均购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.2 试 剂 DMEM 培养基（批号10566016）和胎牛血清（批号10100147）均购自美国Gibco 公司；荧光素酶报告载体OIP5-AS1-WT、OIP5-AS1-MUT、Ⅰ型胶原α1（COL1A1）-WT、COL1A1-MUT 及相应的对照质粒购自上海吉玛生物制药有限公司；双荧光素酶报告基因试剂盒（批号E1910）购自美国Promega 公司；Lipofectamine2000（批号11668500）购自美国Invitrogen 公司；qRT-PCR 试剂盒购自（批号RR42LR）日本TaKaRa 公司；Anti-COL1A1（批号72026S）及山羊抗兔二抗（批号7074S）均购自美国CST 公司；Transwell 小室（批号3422）购自美国Corning 公司。

1.3 主要仪器 General Use Only 离心机，美国Thermo；FormaTMSteri-CycleTMCO2Incubator 培 养箱，美国Thermo；Multiskan FC 酶标仪，美国Thermo；LightCycler 96 荧光定量PCR 仪，德国罗氏；TiS 荧光倒置显微镜，日本尼康；E1960 双萤光素酶报告基因检测系统，美国Promega 公司。

2 实验方法

2.1 细胞培养与转染 将人正常胃细胞GES-1 和胃癌细胞AGS、SGC7901 置于含有10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 U/mL 链霉素的DMEM 培养基中，在5% CO2、37 ℃培养箱中培养，细胞生长至85%时，加入胰酶消化传代培养。将对数生长期的胃癌细胞稀释，然后按照Lipofectamine 2000 试剂盒说明书进行转染。转染细胞分组为阴性对照（si-NC）、si-lncRNA OIP5-AST（si-OIP5-AS1）、NC mimic、miR-143-3p mimic、si-OIP5-AS1+inhibitor NC、si-OIP5-AS1+miR-143-3p inhibitor 和si-OIP5-AS1+miR-143-3p mimic+si-COL1A1。

2.2 Western blot 检测 COL1A1 蛋白表达RIPA 裂解液提取三组细胞总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度。取40 μg 蛋白样品进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。采用常规湿转法转膜，于5%的脱脂牛奶（TBST 溶解）室温下封闭1 h。将膜置于稀释的一抗溶液（1∶2000）室温孵育2 h，PBST 洗膜每隔5 min 洗1 次，洗6 次；再将膜置于稀释的二抗溶液中室温孵育1.5 h（1∶5000），PBST 洗膜5 min，洗6次，化学发光显色剂显色。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）蛋白为内参。

2.3 qRT-PCR 检测miR-143-3p 和OIP5-AS1 的表达 TRIzol 法提取细胞总RNA，反转录为cDNA 进行qRT-PCR 检测。检测lncRNA OIP5-AS1 以βactin 为内参，miR-143-3p 以U6 为内参，使用2－ΔΔCt法计算miR-143-3p 和lncRNA OIP5-AS1 的相对表达水平。反应参数：95 ℃5 min，96 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，35 个循环。所用引物序列（由上海生工生物合成）如下：miR-143-3p 的反转录引物为5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGAGCTA-3'。miR-143-3p 上游引物为5'-CGCGTGAGATGAAGCACTG-3'，下游引物为5'-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3'。U6上游引物为5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物为5'-ACGCT-TCACGAATTTGCGT-3'。OIP5-AS1上游引物为5'-CAGACCTGGCACAATGGCTCAC'-3'，下游引物为5'-GTGGGCTCAAACTGGGCTCAAG-3'。β-actin 上游引物为5'-TGTCAC-CAACTGGGACGATA-3'，下游引物为5'-GGGGTGTT-GAAGGTCTCAAA-3'。

2.4 CCK-8 检测细胞增殖 采用CCK-8 检测试剂盒在96 孔板中测定细胞活力并设置3 个复孔。每孔加入10 μL CCK-8 试剂，在37 ℃黑暗培养箱中连续孵育3 h。使用酶标仪检测在450 nm 处测定吸光度。

2.5 伤口愈合实验检测细胞迁移 将细胞铺到12孔板中，培养达到约100%的融合度。用10 μL 的移液枪枪头在孔底造成划痕，使用预冷的PBS 除去未附壁的细胞至无细胞脱落。将细胞放入不含血清的DMEM 中培养24 h。显微镜下观察细胞迁移距离。

2.6 Transwell 实验检测细胞侵袭 各组细胞用胰酶消化处理后，接种于Transwell 小室24 孔板内，上室加入100 μL 细胞悬液，下室加250 μL 含10%胎牛血清的培养基，在37℃、5% CO2培养箱中培养48h，PBS 冲洗2 次至无细胞碎片，4%多聚甲醛固定细胞15 min，0.1%结晶紫染色15 min 后PBS 冲洗染色液，干燥后显微镜下观察细胞染色情况。

2.7 双荧光素酶报告实验 将构建的OIP5-AS1 野生型载体OIP5-AS1-WT/突变型载体OIP5-AS1-MUT 以及COL1A1 野生型载体COL1A1-WT/突变型载体COL1A1-MUT 分别与NC mimic 或miR-143-3p mimic 共转染，转染成功后继续培养48 h，按双荧光素酶试剂盒操作说明检测荧光素酶活性。

2.8 统计学方法 应用Graph Pad Prism 7.0 统计软件进行数据处理，计量资料符合正态分布，以均数±标准差（）表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用LSD 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 lncRNA OIP5-AS1 在胃癌细胞系表达水平升高 qRT-PCR 测定结果显示，lncRNA OIP5-AS1 在胃癌细胞AGS、SGC7901、BGC823、MKN-45 中表达水平分别是GES-1 细胞的6.10、5.53、3.90 和3.03倍，差异有统计学意义（P＜0.01）。选择表达水平较高的AGS 和SGC7901 细胞进行下一步研究。

3.2 敲低lncRNA OIP5-AS1 抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭 应用siRNA 敲低lncRNA OIP5-AS1 的表达，并通过qRT-PCR 验证AGS、SGC7901 细胞在转染si-OIP5-AS1 后，lncRNA OIP5-AS1 表达水平分别降低至原来的0.25 和0.34 倍（P＜0.05）。通过CCK-8 分析lncRNA OIP5-AS1 对胃癌细胞增殖的影响，结果显示，与si-NC 相比，si-OIP5-AS1 转染的AGS 和SGC7901 增殖明显减少[AGS：（0.71±0.07）比（1.20±0.11）；SGC7901：（1.02±0.10）比（1.80±0.10），P均＜0.05]。此外，分别通过伤口愈合实验和Transwell测定lncRNA OIP5-AS1 对胃癌细胞迁移（见图1）和侵袭（见图2）的影响，结果表明，AGS 和SGC7901 的迁移[AGS：（29.01±3.68）%比（72.04±6.82）%；SGC7901：（23.97±2.24）%比（62.02±3.73）%，P 均＜0.01]和侵袭能力[AGS：（35.68±6.96）个比（278.33±11.85）个；SGC7901：（62.74±12.77）个 比（248.65±12.03）个，P均＜0.01]因lncRNA OIP5-AS1 的敲低而显著减弱。

图1 伤口愈合实验检测si-OIP5-AS1 对胃癌细胞迁移的影响

图2 Transwell 实验检测si-OIP5-AS1 对胃癌细胞侵袭的影响

3.3 miR-143-3p 在胃癌细胞系表达水平显著降低，COL1A1 表达水平升高 qRT-PCR 结果显示，AGS和SGC7901 中miR-143-3p 表达水平分别是GES-1的0.56 和0.49 倍，差异有统计学意义（P＜0.01）。Western blot 结果显示，COL1A1 在胃癌细胞系中的蛋白表达水平显著高于GES-1 细胞（P＜0.01），见图3。

图3 Western blot 检测COL1A1 在胃癌细胞和正常胃细胞中的表达水平

3.4 lncRNA OIP5-AS1 通过吸附miR-143-3p 调控COL1A1 的表达 通过starBase 预测发现lncRNA OIP5-AS1 与miR-143-3p，miR-143-3p 与COL1A1具有结合位点（见图4）。同时，miR-143-3p mimic 显著降低OIP5-AS1-WT 和COL1A1-WT 的荧光素酶活性（P＜0.01）（见表1）。qRT-PCR 结果显示，敲低lncRNA OIP5-AS1 后，AGS 和SGC7901 细胞miR-143-3p 表达水平升高，分别为对照组的2.60 和2.13倍，差异有统计学意义（P＜0.01），而Western blot 结果显示，相比于si-NC 组COL1A1 表达水平显著降低（P＜0.01）；此外，敲低lncRNA OIP5-AS1 对COL1A1 表达的抑制作用能够被miR-143-3p inhibitor 所逆转（P＜0.01），见图5。

图4 starBase 预测lncRNA OIP5-AS1、miR-143-3p、COL1A1的靶向结合位点

图5 Western blot 检测不同处理组胃癌细胞COL1A1 表达

表1 双荧光素酶报告实验分析胃癌细胞lncRNA OIP5-AS1 与miR-143-3p、miR-143-3p 与COL1A1 间的相互关系（）

表1 双荧光素酶报告实验分析胃癌细胞lncRNA OIP5-AS1 与miR-143-3p、miR-143-3p 与COL1A1 间的相互关系（）

注：NC mimic 组为每孔胃癌细胞加入100 nmol 的NC mimic 及5 μL 转染试剂；miR-143-3p mimic 组为每孔胃癌细胞加入100 nmol 的miR-143-3p mimic 及5 μL 转染试剂；OIP5-AS1 为Opa 相互作用蛋白5 反义RNA1；COL1A1 为Ⅰ型胶原α1；与NC mimic 组比较，aP＜0.01

3.5 lncRNA OIP5-AS1 通过调控miR-143-3p/COL1A1 影响胃癌细胞增殖、迁移和侵袭 挽救实验表明，si-OIP5-AS1 对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用，能够被miR-143-3p inhibitor 恢复；在此基础上，敲低COL1A1 能够抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭能力，见表2，图6-7。

图6 伤口愈合实验检测各处理组胃癌细胞的迁移

表2 各处理组胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭（）

表2 各处理组胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭（）

注：si-NC 组为每孔胃癌细胞加入100 pmol 的si-NC 及5 μL 转染试剂；si-OIP5-AS1 组为每孔胃癌细胞加入100 pmol 的si-OIP5-AS1 及5 μL转染试剂；si-OIP5-AS1+miR-143-3p inhibitor 组为每孔胃癌细胞加入100 pmol 的si-OIP5-AS1、100 nmol 的miR-143-3p inhibitor 和5 μL 转染试剂；si-OIP5-AS1+miR-143-3p inhibitor+si-COL1A1 组为每孔胃癌细胞加入100 pmol 的si-OIP5-AS1、100 nmol 的miR-143-3p inhibitor、100 nmol 的si-COL1A1 和5 μL 转染试剂；OIP5-AS1 为Opa 相互作用蛋白5 反义RNA1；COL1A1 为Ⅰ型胶原α1；与si-NC 组比较，aP＜0.01；与si-OIP5-AS1 组比较，bP＜0.01；与si-OIP5-AS1+miR-143-3p inhibitor 组比较，cP＜0.01

4 讨论

由于早期胃癌缺乏特异性症状，大多数胃癌患者确诊时已为中晚期，预后差。目前被证实的胃癌高危因素包括幽门螺杆菌感染、过量摄入盐和硝酸盐、肥胖等，此外，异常的分子信号通路也参与了胃癌的发生和转移[9]。lncRNA 的失调参与了癌症中的细胞增殖、肿瘤进展和转移，同时，lncRNA 作为miRNA的分子海绵，阻断靶转录本的结合活性[10]。已有多种lncRNA 被鉴定为致癌或抑癌因子，如XIST、GAS5、HOTAIR 和MALAT1[11]。lncRNA 已被证明参与了不同癌症类型，据报道lncRNA OIP5-AS1 通过靶向调控miR-378a-3p 促进肺癌细胞的增殖，而敲低lncRNA 表达会抑制肺癌细胞的增殖[12]。Yang 等[13]也发现，lncRNA OIP5-AS1 通过调控miR-410 的表达调控其靶基因KLF10，从而促进多发性骨髓瘤细胞增殖、周期进展和抑制凋亡，影响下游信号通路。本研究也发现，lncRNA OIP5-AS1 在胃癌细胞系中表达水平显著升高。

图7 Transwell 实验检测各处理组胃癌细胞AGS 和SGC7901 的侵袭

多项研究表明，miR-143 在人类癌症中表达下调，其中miR-143-3p 发挥肿瘤抑制因子的关键作用，通过靶向癌基因参与人类癌症的发病过程，靶向HK2 在食管鳞状细胞癌中发挥作用[14]。miR-143-3p表达下调与卵巢癌的进展有关[15]。这说明miR-143-3p 的表达与肿瘤的发生发展有直接的关系。本研究结果显示，miR-143-3p 抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

COL1A1 基因编码Ⅰ型胶原的α1 链，是主要的细胞外基质成分，已在多种类型的癌症中被证实。据报道COL1A1 在胃癌中表达上调，并影响胃癌细胞侵袭转移[16]。本研究结果显示，COL1A1 在胃癌细胞中表达上调，促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

本研究中，生物信息预测miR-143-3p 的上下游靶标分子，发现miR-143-3p 能够靶向作用于lncRNA OIP5-AS1，以及下游COL1A1 mRNA 的3’-UTR，双荧光素酶报告实验以及挽救实验进一步证实了lncRNA OIP5-AS1 通过海绵吸附miR-143-3p 上调COL1A1 促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭进，影响胃癌细胞的发展。