抗早1 号对DEHP 联合BPA 诱导的雌性性早熟大鼠的治疗作用及机制研究

郑月琳 盛丽先 王其莉 何蓓晖

性早熟是儿童内分泌专科最常见的就诊原因之一[1]。研究显示，女孩和男孩性早熟发病率分别高达11.47%和3.26%[2]。性早熟的发病原因复杂，与遗传、性别、肥胖等相关，同时也受到环境因素的影响。如已被证实环境内分泌干扰物（EEDs）与儿童性早熟的发生有密切关系[3]。日常生活中常见的EEDs 有邻苯二甲酸酯（PAEs）、双酚A（BPA）等，其中PAEs 代表物质包括邻苯二甲酸丁基苄基酯（BBP）、邻苯二甲酸二酯（DEHP）等，广泛存在于各类塑料制品及玩具中，不但可造成女童性早熟，也可能造成男童性发育异常[3-4]。全国名老中医盛丽先教授在长期临床诊治中，自拟经验方抗早1 号治疗性早熟，取得了显著的疗效。本文通过建立DEHP 联合BPA 诱导的雌性性早熟大鼠模型，探讨抗早1 号对染毒性早熟模型尿PAEs 相关代谢产物的影响及作用机制，现报道如下。

1 实验材料

1.1 动 物 32 只雌性SD 大鼠购买于上海斯莱克实验动物有限公司，21 日龄，体质量50～59 g，无特定病原体级。动物许可证号：SCXK（沪）2017-0005。动物饲养于浙江中医药大学实验动物中心，相对湿度55%，温度25 ℃，自然光照，自由进食及进水。本研究通过浙江中医药大学实验动物管理与伦理委员会审核备案（批准号：IACUC-20200506-17）。

1.2 药 物 抗早1 号由生地黄、炙龟板、黄柏、知母、茯苓各9 g，泽泻、柴胡、路路通各6 g 组成，中药材饮片由浙江省中医院中药房提供并负责煎煮，水煎液药物浓度为1.0 g/mL。

1.3 主要仪器及试剂 超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪：配有电喷雾离子源（美国Waters 公司，型号：UPLC-TQ Detector），由杭州谱胜检测科技有限公司检测。DEHP 和BPA（上海阿拉丁生化有限公司，批号D294897、B108653）；黄体生成素（LH）、雌二醇（E2）试剂盒（南京建成公司，批号H206-1-1、H102-1）；磷酸二氢钠（分析纯）（批号7558-80-7）、磷酸氢二钠（分析纯）（批号7558-79-4）、乙酸铵（分析纯）（批号631-61-8）、甲醇（色谱纯）（批号67-56-1）、乙腈（色谱纯）（批号75-05-8）、甲酸（色谱纯）（批号64-18-6）、乙酸（色谱纯）（批号64-19-7）、β-葡萄糖醛酸脱氢酶（批号BGALS-RO）均购于德国Merck 公司。

2 实验方法

2.1 分组及造模 32 只雌性21 日龄未成熟大鼠，应用随机数字表法分为正常组，模型组，抗早1 号低、高剂量组，每组8 只。模型组及抗早1 号低、高剂量组均于21 日龄予DEHP 400mg/kg 加BPA 200mg/kg联合灌胃，1 次/d，共7 d，建立性早熟大鼠模型[5-6]。抗早1 号低、高剂量组于28 日龄灌胃给药干预，模型组和正常组予等剂量生理盐水灌胃，抗早1 号高、低剂量组大鼠分别灌服浓度10.08、5.04 mg/（g·次），灌胃量均为1.2 mL/（只·次），1 次/d。共干预7 d。DEHP染毒后的24 h 开始，每天检查并记录四组大鼠阴道开口情况。给药7 d 后，留取各组大鼠24 h 尿液，大鼠称重。采用3%戊巴比妥钠腹腔注射进行麻醉。腹主动脉取血，处死大鼠后进行相关检测。

2.2 HE 染色观察子宫、卵巢病理学改变 各组大鼠麻醉后处死，迅速分离卵巢、子宫，称重后，甲醛溶液固定，经脱水后，常规石蜡包埋切片（3 μm），苏木精-伊红（HE）染色，光镜下观察大鼠卵巢卵泡发育情况。计算子宫、卵巢系数，器官系数=器官湿质量/体质量。

2.3 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清LH、E2 水平 各组大鼠取动脉血，4 ℃下4000 r/min 离心10 min后，分离血清待用。各孔加入血清/标准品50 μL，然后加入生物素抗原工作液50 μL，轻轻摇晃，盖上封板膜，37 ℃培养箱中孵育30 min。第1 次洗涤，小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加入洗涤液，静置30 s 后弃去，重复5 次，拍干。加入50 μL 亲和素-辣根过氧化物酶到各孔中，轻轻摇晃，盖上封板膜，37 ℃培养箱中孵育30 min。第2 次洗涤，步骤同上。显色：每孔加入显色剂A 50 μL，再加入显色剂B 50 μL，37 ℃避光显色10 min。每孔加入终止液50 μL，终止反应。以空白孔调零，450 nm 波长测定各孔吸光度（OD 值）。

2.4 DEHP 代谢物检测 各组大鼠分别加入防腐剂后收集24 h 尿液，离心后吸取1 mL 尿液于2 mL EP 管中，加入10 μL 混合同位素内标工作液和200 μL 1 mol/L 乙酸铵水溶液（pH 5.0）以及10 μL β-葡萄糖醛酸脱氢酶；混合物涡旋1 min 后放置于37 ℃恒温水浴箱中过夜酶解。并过滤净化后，经反相色谱柱通过梯度洗脱分离测定尿中PAEs 代谢产物水平，具体代谢物见表1。

表1 邻苯二甲酸酯代谢产物

2.5 统计学方法 应用SPSS 22.0 对实验数据进行统计分析，计量资料均符合正态分布，采用均数±标准差（）表示。多组均数比较，方差齐时，采用SNK（Student-Newman-Keuls）检验法；方差不齐时，采用秩和（Kruskal-Wallis）检验法。以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 抗早1 号对性早熟大鼠阴道开口时间、子宫和卵巢系数的影响 观察四组阴道开口情况，模型组平均阴道开口时间较正常组明显提前（P＜0.01）。与正常组比较，病理光镜下发现，性早熟模型组大鼠的子宫壁增厚，子宫腺体增多，局部可见上皮细胞空泡化，提示DEHP+BPA 诱导的雌性性早熟大鼠造模成功。与模型组比较，抗早1 号低、高剂量组均有延缓阴道开口时间的作用（P＜0.01）。与正常组比较，模型组的子宫系数显著升高（P＜0.05），卵巢系数有升高趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。经抗早1 号治疗后，子宫、卵巢系数明显下降，其中抗早1 号高剂量组与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.01 或P＜0.05）。见表2。

表2 抗早1 号对阴道开口时间、子宫和卵巢系数的影响（）

表2 抗早1 号对阴道开口时间、子宫和卵巢系数的影响（）

注：模型组及抗早1 号低、高剂量组均于21 日龄给予邻苯二甲酸二酯400 mg/kg 加双酚A 200 mg/kg 联合灌胃；28 日龄模型组和正常组予1.2 mL/只生理盐水灌胃，抗早1 号低、高剂量组分别灌服浓度5.04、10.08 mg/（g·次）抗早1 号，灌胃量均为1.2 mL/只；与正常组比较，aP＜0.05，bP＜0.01；与模型组比较，cP＜0.05，dP＜0.01

3.2 抗早1 号对性早熟大鼠子宫和卵巢病理的影响与正常组比较，模型组大鼠子宫壁增厚，局部可见上皮细胞空泡化。与模型组比较，抗早1 号低、高剂量组子宫壁厚度降低。与正常组比较，模型组可见较多的生长卵泡与成熟卵泡。与模型组比较，抗早1 号低、高剂量组卵泡数量减少。见图1。

图1 各组大鼠子宫、卵巢病理图（苏木精-伊红染色，×100）

3.3 抗早1 号对性早熟大鼠血清E2、LH 的影响与正常组比较，模型组血清E2、LH 显著升高（P＜0.05或P＜0.01）。经抗早1 号低剂量治疗后，血清E2 明显降低（P＜0.05），LH 也下降，但差异无统计学意义（P＞0.05）；抗早1 号高剂量治疗后，血清E2 和LH 明显降低（P＜0.01）。见表3。

表3 抗早1 号对性早熟大鼠血清E2、LH 的影响（）

表3 抗早1 号对性早熟大鼠血清E2、LH 的影响（）

注：模型组及抗早1 号低、高剂量组均于21 日龄给予邻苯二甲酸二酯400 mg/kg 加双酚A 200 mg/kg 联合灌胃；28 日龄模型组和正常组予1.2 mL/只生理盐水灌胃，抗早1 号低、高剂量组分别灌服浓度5.04、10.08 mg/（g·次）抗早1 号，灌胃量均为1.2 mL/只；E2 为雌二醇；LH 为黄体生成素；与正常组比较，aP＜0.05，bP＜0.01；与模型组比较，cP＜0.05，dP＜0.01

3.4 抗早1 号对性早熟大鼠尿PAEs 代谢产物的影响 与正常组比较，模型组大鼠尿PAEs 代谢产物MEHP、MEOHP、MEHHP、MECPP、MCMHP 显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，抗早1 号低、高剂量组尿MEHP、MEOHP、MEHHP、MECPP、MCMHP 显著降低（P＜0.01）。见表4。

表4 抗早1 号对性早熟大鼠尿PAEs 代谢产物的影响（μg/mL，）

表4 抗早1 号对性早熟大鼠尿PAEs 代谢产物的影响（μg/mL，）

注：模型组及抗早1 号低、高剂量组均于21 日龄予邻苯二甲酸二酯400 mg/kg 加双酚A 200 mg/kg 联合灌胃；28 日龄模型组和正常组予1.2 mL/只生理盐水灌胃，抗早1 号低、高剂量组分别灌服浓度5.04、10.08 mg/（g·次）抗早1 号，灌胃量均为1.2 mL/只；PAEs 为邻苯二甲酸酯；MEHP 为邻苯二甲酸单乙基己基酯；MEOHP 为邻苯二甲酸单乙基酮基己基酯；MEHHP 为邻苯二甲酸单乙基羟基己基酯；MECPP 为邻苯二甲酸乙基羟基戊基酯；MCMHP 为单邻苯二甲羟基己基酯；与正常组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.01

4 讨论

性早熟是儿童提早出现第二性征发育的内分泌异常性疾病，对患儿身心健康可产生不良影响，加剧家长焦虑情绪及社会医疗支出[7]。性早熟的发病，特别是中枢性性早熟具体病因及分子机制尚不明确，现EEDs 已被证实与儿童性早熟的发生有密切关系[3]。DEHP 和BPA 是最常见的EEDs，有雌激素样作用，可在城市用水、空气、日常用品、植物蔬菜及动物体内广泛检测出[8-10]。实验证明，DEHP 进入体内代谢为MEHP，后者可作用于细胞表面雌激素受体α，干扰DNA 甲基化，进而刺激细胞异常增殖、分化，而这种毒性作用呈浓度依赖性[8-9]。BPA 作为世界上最高产量的化学品之一，同样具有类雌激素样作用，BPA 在性早熟中的致病机制近年成为研究热点[10]。本实验中以未成熟SD 雌性大鼠（21 日龄，青春前期）作为造模开始的时间节点，这个时期大鼠对EEDs 的敏感程度明显增高。另外，鉴于正常大鼠的平均阴道开口时间为35 d 左右，故选择28 日龄作为给药的干预节点。观察四组阴道开口情况，性早熟模型组平均阴道开口时间较正常组明显提前，说明DEHP+BPA 诱导的雌性性早熟模型大鼠造模成功。同时，与正常组比较，病理光镜下发现，性早熟模型组大鼠的子宫壁增厚，子宫腺体增多，局部可见上皮细胞空泡化，也提示造模成功。

目前国内外普遍采用促性腺激素释放激素类似物治疗中枢性性早熟，在疗效和安全性上具有明显的优势，在我国也有极其广泛的应用[1，11]。但其使用有严格的适应证，且存在价格昂贵，疗程长，依从性差等缺点，而大量临床实验证明中医辨治性早熟安全有效[12-13]。抗早1 号主要药物为生地、炙龟板、黄柏、知母、柴胡、路路通、茯苓、泽泻。方中黄柏、知母泻相火；生地、龟板滋肾阴；柴胡、路路通疏肝气；泽泻、茯苓泻降湿浊。盛教授总结，天癸是以肾精充沛为基础，并由肾气激发而产生，它可以促进性腺外观及内在功能发育成熟旺盛。天癸提前形成成熟，会使儿童提前出现月经等情况，其中医病机与西医“下丘脑-垂体-性腺轴”的萌动在功能和空间特性上具有相似之处。中医的“肾阴虚相火旺”即为性调节轴的失调、亢进。EEDs 诱发性早熟的中医病机为肾阴不足，相火上亢，肝郁气滞，湿浊内阻。抗早1 号全方合奏，正是治以滋阴降火，疏肝泄浊，达到抑制性早熟的作用。

本研究通过干预DEHP 联合BPA 诱导建立的性早熟模型大鼠，明确抗早1 号显著延缓性早熟大鼠阴道开口时间及性腺发育。与模型组比较，抗早1号可以降低血清LH、E2 值，同时可显著降低尿PAEs代谢产物。我们据此推测抗早1 号可能通过加速体内EEDS 的分解及排除，从而发挥防治性早熟的作用。