高致病性猪繁殖与呼吸综合征RPA-LFD诊断方法的建立及初步应用

曾越琰，李超越，任玉鹏，张焕容

(西南民族大学畜牧兽医学院，四川 成都 610041)

猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)给全球养猪业带来了巨大的经济损失，其中，高致病性猪繁殖与呼吸综合征(Highly pathogenic PRRS，HP-PRRS)至今仍持续危害我国养猪业的发展.HP-PRRSV为引起HPPRRS的病原，HP-PRRSV基因组在非结构蛋白2(Nsp2)的编码区域存在1＋29个不连续的30个氨基酸缺失[1-2].PRRSV基因组的变异，导致出现新毒株，这种变异给建立特异的检测方法带来了挑战.

国内很多学者建立了检测HP-PRRSV的PCR或荧光PCR方法，如根据PRRSVNsp2基因建立了可区分普通PRRSV和HP-PRRSV的一步RT-PCR方法[3]，区分不同毒株的套式PCR方法[4]，可对HPPRRSV进行高通量检测的荧光定量RT-PCR[5]，区分HP-PRRSV JXA1-R、HP-PRRSV和C-PRRSV的多重PCR方法[6]，根据三种不同PRRSV株的Nsp2基因序列设计引物和TaqMan探针，建立同时检测PRRSV、HP-PRRSV、NADC30的荧光定量PCR方法[6]等.这些方法各有优点，但无法满足临床现场快速检测.

即时检测(Point of care testing，POCT)技术是近年来兴起的一类新型快速检测技术，特点在于不依赖实验室条件，操作简单，设备便携，特别适宜于病原的现场快速检测.重组酶聚合酶扩增技术(Recombinaseploymerase amplification，RPA)是即时检测的代表之一，该技术以T4噬菌体DNA复制机制为基础，检测体系需要一种常温下能工作的DNA聚合酶、一个噬菌体uvsX重组酶、一个单链DNA结合蛋白(gp32)，以及另外一个辅助uvsX重组酶的uvsY蛋白[7-8]，不依赖类似于PCR仪热敏元件所提供的控温系统，在常温下10～20 min即可完成DNA的快速扩增.该技术结合侧流层析技术(Lateral Flow Immunoassay for Rapid Detection，Lateral Flow Dipstick，LFD)形成的RPA-LFD方法，将扩增产物与缓冲液混合，插入LFD试纸条，5 min左右即可肉眼观察到实验结果，无需凝胶电泳，就可直观判定结果，且操作非常简便，适用于现场快速检测.

本研究以HP-PRRSVNsp2基因特有的序列为靶标，设计出特异性引物与探针，建立一种现场快速检测HP-PRRSV的RPA-LFD检测技术，并对其特异性、灵敏性和稳定性进行评价，并与检测HP-PRRSV的商品试剂盒进行比较，从而为HP-PRRSV现场快速检测提供一种可靠的方法.

1 材料与方法

1.1 材料

HP-PRRSV、PRRSV VR2332、PRRSV NADC30-like和猪瘟(Classic Swine Fever Virus，CSFV)的阳性核酸由四川省动物疫病预防控制中心提供.猪流行性腹泻(PEDV)DY株细胞毒、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪圆环2型病毒(PCV-2)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪链球菌SWUN112株(S.suis)、猪源大肠杆菌SWUN145株(E.coli)阳性核酸由西南民族大学动物医学实验室保存.

TwistAmp nfo、TwistAmp Basic试剂盒购自Twist DX公司；Milenia Genline HybriDetect(侧流层析试纸条)购自德国Milenia Biotec公司；高致病性猪蓝耳病病毒荧光PCR检测试剂盒(PRRSV-M)购自上海恒雅生物科技有限公司；Gel Extraction kit(100)D2500-01胶回收试剂盒，Plasmid Mini kit I(100)质粒提取试剂盒购自OMEGA公司；TRIzolTM试剂购自美国Thermo Fisher Scientific公司；克隆载体pMD19-T、反转录试剂盒购自Takara公司；DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司.

从四川绵阳、西昌、广元等地规模化养殖场疑似PRRSV感染的母猪无菌采集50份猪血清，置-80℃冻存备用.

1.2 重组质粒标准品的构建与鉴定

以HP-PRRSV核酸为模板，扩增其Nsp2基因的保守序列，引物序列为F:5′-TCCCGTGACTCAAGAGCCT-3′，R:5′-CCGACAGTTTCTTCCGAACC-3′.反应条件94℃，5 min；94℃，30 s；56℃，30 s；72℃，45 s，35个循环；72℃，10 min，扩增目的片段为504 bp.扩增产物胶回收连接pMD19-T载体，克隆转化至大肠杆菌感受态细胞中，提取质粒，并将其命名为pMD19-TNsp2.经PCR鉴定及重组质粒测序鉴定正确后，利用核酸蛋白仪测定质粒标准品浓度，根据公式计算拷贝数:拷贝数(copies/μL)＝6.02×1023×质粒浓度(ng/μL)×10-9/(质粒碱基数×660).

1.3 RPA-LFD引物与探针的设计和筛选

根据NCBI登录的PRRSV VR2332、HP-PRRSV和NADC30-Like多个毒株Nsp2基因序列(登录号分别为，HP-PRRSV:EF112445.1、EF635006.1、KX9803 92.1、MN046234.1、MN642105.1、MN642103.1；NADC 30-likePRRSV:JN654459.1、KT945017.1、KT945018、KR706343.1、MG687491.1、MH651744.1；PRRSV VR2332:AY150564)，利用MegAlign软件比对分析，根据Nsp2基因的缺失情况，按照RPA引物探针设计原则，使用Primer 5.0软件设计4对引物和1条探针(表1)，下游引物需要在5′端添加生物素(Biotin)，探针的5′端添加FAM荧光标记，探针的3′端添加C3-spacer，在距离探针5′端至少30 bp，距离3′端至少15bp处用[THF]取代其中一个碱基，引物和探针均由上海生工生物股份有限公司提供.

表1 RPA引物及探针Table 1 Primers and probe for RPA

采用TwistAmp Basic RPA试剂盒，按如下反应体系:上下游引物各2.4 μL(0.42 pmol/μL)，Rehydration Buffer 29.5 μL，ddH20 12.2 μL，模板1 μL，MgOAc 2.5μL，在37℃条件下，反应20 min，同时将表1设计的引物以HP-PRRSV cDNA为模板进行RPA扩增，扩增完成后加入等体积的酚-氯仿进行纯化，琼脂糖凝胶电泳观察特异性目的片段扩增情况，筛选出最佳引物，用于后续试验.

1.4 RPA反应条件的优化

根据TwistAmp Basic RPA试剂盒说明书，按照50 μL反应体系，将以下各组分加入试剂盒特定反应管中.各组分具体为:上、下游引物各2.1 μL，探针0.6 μL，Rehydration buffer 29.5 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 12.2 μL，共47.5 μL，涡旋混匀后离心；再向特定反应管中加入2.5 μL MgOAc溶液涡旋离心，立即放入恒温水浴锅(30℃、35℃、37℃、40℃、42℃)中反应一定时间(10 min、15 min、20 min、25 min、30 min)，反应结束立即置冰盒上终止反应.取5 μL反应液混入70 μL running缓冲液中，涡旋混匀，将Milenia GenlineHybridetect试纸条插入液体中反应5 min，观察试纸条上是否出现相应的条带.

根据最佳反应条件，进一步对引物浓度(0.042、0.21、0.42、1.05、2.1 pmol/μL)和探针浓度(0.012、0.06、0.12、0.3、0.6 pmol/μL)进行优化，优化的标准为出现明显的特异性条带的最低引物浓度和探针浓度.

1.5 特异性试验

以HP-PRRSV、PRRSV VR2332、NADC30-like、PEDV、TGEV、PRV、PCV-2、CSFV、S.suis、E.coli的cDNA或DNA为模板，以最佳的反应条件进行RPA反应.同时，以ddH2O取代模板作阴性对照.取5 μL反应液混入70 μL running缓冲液中，涡旋混匀，将Milenia Genline Hybridetect LFD试纸条插入液体中反应5 min，观察试纸条上是否出现条带.

1.6 敏感性试验

质粒标准品进行10倍系列稀释后(106拷贝/μL～100拷贝/μL)作为模板，以最佳的反应条件进行RPA反应，确定RPA-LFD对质粒标准品的最小检出量.同时利用商品化HP-PRRSV荧光PCR检测试剂盒检测，对比分析两种方法的检测结果.商品化检测试剂盒判断标准为:阳性:检测通道Ct值≤35，曲线具有明显的指数增长曲线；可疑:检测通道35＜Ct值≤38，建议重复检测，如果检测通道仍为35＜Ct值≤38，且曲线有明显的增长曲线，判定为阳性，否则为阴性；阴性:样本检测结果Ct值＞38或无Ct值.

1.7 重复性试验

以106拷贝/μL、103拷贝/μL、101拷贝/μL 3个浓度的质粒标准品为模板，每个浓度重复3次检测，分别进行批间与批内重复性试验，以确定此方法的重复性.

1.8 临床样品检测

无菌采集50份临床疑似PRRSV感染猪的前腔静脉血，装入EP管，室温静置1～2 h，2 000 r/min离心10 min，取上清.利用建立的RPA-LFD方法对50份猪血清样品cDNA进行检测，分析该方法在临床上应用的可行性.此外，使用商品化HP-PRRSV荧光PCR检测试剂盒对相同样品进行检测，对两种方法的检测结果进行比较分析.

2 结果

2.1 质粒标准品的构建与鉴定

HP-PRRSVNsp2基因扩增产物电泳结果显示，在约500 bp处出现特异性条带，扩增条带与预期的目的片段大小一致，阴性对照无扩增(图1).重组质粒pMD-19T-Nsp2质粒浓度为141.9 ng/μL，质粒碱基数3 196 bp，计算拷贝数为4.05×1010拷贝/μL，该浓度质粒标准品可用于所建立方法的敏感性检测.

图1 PRRSV Nsp2基因PCR扩增产物凝胶电泳结果M:DL 2000分子量标准；1:HP-PRRSV Nsp2扩增产物；2:阴性对照Fig.1 Electrophoresis result of PRRSV Nsp2 geneM:DL 2000 Marker；1:HP-PRRSV Nsp2 gene；2:Negative control

2.2 引物筛选结果

经初步RPA反应，电泳结果如图2所示，引物1F1R扩增的条带与目的片段大小一致，条带亮度强，引物2F2R未扩增出目的条带，引物3F3R扩增条带与目的条带基本一致，但条带亮度相对较弱，引物4F4R未扩增出目的条带，所以最终确定1F1R为最佳引物，筛选出的HP-PRRSV RPA-LFD引物序列为F:5′-TTCATCACCGTGAGAGGTTAAATTCCGTAC-3′，R:5′-Biotion-TGTCCACCGCGGGTAGCTTTTGACCCAA GC-3′，探 针 序 列 为:5′-FAM-TGTCCACTGGACTTGGCCCGCGACCCGTGCT[THF]CCGAGCGGGCTCGACGC3spacer-3′.

图2 PRRSV RPA引物筛选M:DL 2000分子量标准；1:1F1R引物对扩增产物；2:2F2R引物对扩增产物；3:3F3R引物对扩增产物；4:4F4R引物对扩增产物；5:阴性对照Fig.2 PRRSV RPA primer screeningM:DL 2000 Marker；1:1F1R；2:2F2R；3F3R；4:4F4R，5:Negative

2.3 反应条件的优化结果

反应时间优化结果表明，反应10 min的产物，LFD检测即出现条带，随着反应时间延长，LFD上条带颜色逐渐加深.反应时间在20 min，LFD条带颜色深浅与25 min和30 min一致，表明其最佳反应时间为20 min.反应温度为37℃时，检测线和控制线条带均最明显，最佳反应温度为37℃；引物及探针的浓度分别为0.42 pmol/μL(2.1 μL)、0.3 pmol/μL(0.6 μL)时，LFD试纸条上的特异性扩增条带最清晰，如图3所示.综上，该RPA-LFD的最佳反应时间为20 min，最佳反应温度为37℃，最佳引物和探针浓度分别为0.42、0.3 pmol/μL.

图3 RPA-LFD反应条件优化结果Fig.3 Optimization results of RPA-LFD reaction conditions

2.4 特异性

用本试验建立的HP-PRRSV RPA-LFD方法对包括HP-PRRSV、PRRSV VR2332和NADC30-like毒株在内的10种病原进行检测，结果只有HP-PRRSV的试纸条上同时出现检测线和质控线，PRRSV VR2332、NADC30-like、PEDV、TGEV、PRV、PCV-2、CSFV、S.suis、E.coil及阴性对照只出现质控线(图4).表明本试验建立的HP-PRRSV RPA-LFD方法特异性好.

图4 HP-PRRSV RPA-LFD特异性试验结果Fig.4 Specificity of the RPA-LFD for HP-PRRSV

2.5 敏感性

以4.05×106拷贝/μL～4.05×100拷贝/μL的质粒标准品为模板进行RPA-LFD和试剂盒的敏感性检测，结果显示RPA-LFD和试剂盒的最低检测限均为4.05×101拷贝/μL(图5和表2).表明该方法灵敏性高.

表2 RPA-LFD方法和商试剂盒敏感性检测结果Table 2 RPA-LFD method and commercial kit sensitivity test results

图5 RPA-LFD敏感性试验结果Fig.5 Sensitivity results of RPA-LFD

2.6 重复性

批间重复试验和批内重复试验结果表明该方法重复性良好(图6和图7).

图6 RPA-LFD批间重复试验结果Fig.6 RPA-LFD inter-batch repeat test results

图7 RPA-LFD批内重复试验结果Fig.7 RPA-LFD intra-batch repeat test results

2.7 临床样品检测结果

50份血清进行RPA-LFD和商品试剂盒检测，结果表明两种方法均检出对应的22份阳性样品，28份阴性样品，所建立的RPA-LFD方法与商品试剂盒阴阳性符合率均为100%(表3).表明该方法可以用于现场检测.

表3 RPA-LFD与商品试剂盒临床样品检测Table 3 RPA-LFD and commercial kit clinical sample testing

3 讨论

为现场快速诊断HP-PRRS，本研究以HPPRRSVNsp2基因特有序列为靶标设计的特异性引物及探针，靶向HP-PRRSV，建立了一种即时快速检测的HP-PRRSV RPA-LFD方法.该方法对包括PRRSV VR2332和NADC-30like毒株在内的9种常见感染猪的病原均不检出，表明本研究建立的HP-PRRSV RPA-LFD方法具有良好的特异性.该方法在37℃条件下反应20 min的产物取5 μL与专属缓冲液混匀后插入LFD试纸条，经5 min即可肉眼观察到结果，与马国和，彭遥等研究报道的反应条件基本一致[9-10]，表明该方法易标准化.

目前RPA在细菌，病毒，支原体和寄生虫等领域均有应用.Li等建立了一种快速检测食品中沙门菌的RPA-LFD方法，在37℃下反应10 min即可检测，且最低检测限度为1.29×101CFU/mL[11].Wang等建立的犬瘟热病毒RT-RPA方法，在40℃条件下，反应3～12 min即可获得结果，最低检测限可至31.8拷贝[12].王建昌建立了非洲猪瘟的basic-RPA检测方法，在38℃水浴锅中恒温反应30 min，即可实现对目的片段的有效扩增，该方法的检测限达到102拷贝，同世界动物卫生组织(OIE)推荐的实时荧光定量PCR方法检测限一致，但比OIE推荐方法的检测限高10倍[13].综上，应用RPA建立的即时检测方法在保证准确性的同时，兼备良好的灵敏性，具有很大的应用价值.本研究建立的检测方法在此基础上还保证了良好的特异性，为HP-PRRS的诊断提供了快速、敏感、特异且能满足临床现场检测需求的新方法.

基于RPA原理常见的检测方法主要有basic-RPA，荧光定量RPA和RPA-LFD，3种RPA都具有灵敏度高，反应迅速，特异性强的优点.basic-RPA检测速度比普通PCR快3～5倍，且灵敏度比普通PCR高10～100倍.但basic-RPA反应产物需纯化后用琼脂糖凝胶电泳检测[14].实时荧光定量RPA相比于basic-RPA，其反应体系中增加了核酸外切酶III(endonuclease III，即exo)和带有exo酶的探针，检测成本高于basic-RPA，且需要昂贵的荧光定量PCR仪，对操作人员的要求也较高.RPA-LFD是在basic-RPA基础反应体系中增加核酸外切酶Ⅳ(endonucleaseⅣ，即nfo)和带有nfo酶的探针，且在下游引物的5′端标记生物素，通过LFD试纸条上抗生物素抗体捕获扩增产物的方式实现可视化即时检测，不依赖于专业实验室和专用设备，但需购买商品化的LFD试纸条，增加了检测成本.

目前仍没有专门设计RPA引物和探针的软件，且其引物和探针更长，其设计的难度比实时荧光定量PCR引物和探针设计大.RPA是近年新出现的即时检测技术，虽在病毒、细菌、寄生虫等病原的检测中均有应用，但不如PCR等常规技术应用广泛，且成本较高.为降低检测成本，于博[15]等在建立布鲁氏菌RPA-LFD检测方法时，将试剂盒推荐的50 μL反应体系减半至25 μL，其研究结果表明体系减半不影响试验结果，反而有效降低了方法的成本.本研究也尝试将体系减半，检测结果与试剂盒推荐的50 μL反应检测结果一致.未来，亟需降低RPA成本及开发RPA引物设计软件，满足生产应用上便捷、经济的需求，使其能普及和服务于生产.