微小核糖核酸-200b-3p、血管内皮生长因子A在食管鳞状细胞癌组织中的表达及其与复发转移相关性

张晶，安秀英，胡锋超

食管鳞状细胞癌是发生在食管鳞状上皮的一种恶性肿瘤，病死率高，据统计，食管癌根治性手术治疗后，局部复发率仍在25%～60%［1-2］。目前，组织分化程度和TNM分期是临床医师判断食管鳞状细胞癌病人预后的主要指标，但临床常有预后与分期不符的现象［3-4］。因此，在分子水平上寻找敏感、特异的预后指标，提供个体化的预后信息，具有重要的临床意义。为了提高病人生存质量和生存时间，改善病人预后，寻找与食管鳞状细胞癌复发转移相关的分子标志物非常重要。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是迄今为止发现的特异性最高、作用最强的血管生长因子，其主要家族成员为血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA），生物学作用是促进血管内皮细胞增殖，诱导新生血管形成和增加血管的通透性，参与食管鳞状细胞癌发生、发展［5-6］。微小核糖核酸-200b-3p（microRNA-200b-3p，miR-200b-3p）属于微小核糖核酸（microRNA，miRNA），可参与细胞分化、代谢等生理病理过程。研究发现miR-200b-3p可通过靶向下调VEGFA表达，在胰腺癌细胞增殖、迁移等过程中发挥抑制作用［7］。但二者是否共同参与食管鳞状细胞癌病人复发转移，目前尚不清楚。因此，本研究通过检测食管鳞状细胞癌组织中miR-200b-3p、VEGFA表达，并结合临床病理特征及随访资料，分析二者表达与病人复发转移的关系，为制定个体化治疗策略及改善食管鳞状细胞癌病人预后提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料回顾性收集2013年12月至2015年12月在河北省退役军人总医院接受手术切除且经组织病理证实的95例食管鳞状细胞癌病人为研究对象，收集食管鳞状细胞癌组织及相应的癌旁正常组织（距癌组织＞5 cm，经HE染色显示无癌细胞浸润）。其中男性48例，女性47例；年龄（63.61±3.70）岁；按TNM分期标准［8］ⅠA～ⅡB期14例，ⅢA～ⅣA期81例；浸润深度T1～T2期28例，T3～T4期67例；肿瘤高分化15例，中低分化80例；有淋巴结转移46例，无淋巴结转移49例。纳入标准：病人在术前均为初治，均未有放化疗等抗肿瘤治疗且无手术禁忌；病人经病理诊断证实为食管鳞状细胞癌；均为R0切除病人；资料完整。排除标准：术后病理证实为高级别上皮内瘤变的病人；合并有其他恶性肿瘤者；合并患有心脏病、肝病、高血压等疾病者；随访资料缺失。

1.2 方法

1.2.1 miR-200b-3p、VEGFA mRNA表 达 情 况 检测 采用实时荧光定量PCR法检测各组织中miR-200b-3p、VEGFA mRNA表达，按照TRIzoI试剂盒（上海杰美基因医药科技有限公司）提取食管鳞状细胞癌及相应癌旁组织中总RNA，反转录得cDNA后进行扩增。miR-200b-3p正向引物：5'-GCCGCTAATACTGCCTGGTAATG-3'，反 向 引 物 ：5'-GTGCAGGGTTCCGAGGT-3'；内 参U6正 向 引 物 ：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAA-3'，反向引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。VEGFA mRNA正向引物：5'-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3'，反向引物：5'-AGGGGCCATGCTAATCTTCT-3'；内 参GAPDH正向引物：5'-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3'，反向引物：5'-GCCATCACGCCACAGTTTC-3'。反应条件为：95℃、5 min，95℃、30 s，60℃、30 s，一共进行40个循环。重复3次，miR-200b-3p、VEGFA mRNA相对表达量以2-ΔΔCt公式进行计算。本研究以miR-200b-3p相对表达量＜均值者45例为低表达，≥均值者50例为高表达。

1.2.2 VEGFA表达情况检测 采用免疫组化法检测各组织中VEGFA表达情况。各组织标本固定后，石蜡包埋、切片，厚度约4 μm，展片后于60℃烘烤1 h；切片经常规二甲苯脱蜡，无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇水化；然后石蜡切片采用枸橼酸钠缓冲液煮沸18 min进行抗原热修复；再滴加3%过氧化氢于室温孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶；而后经磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）冲洗3 min×3次，滴加1%牛血清白蛋白，孵育30 min封闭非特异性结合位点；吸弃封闭液（阴性对照除外），然后滴加兔抗人VEGFA抗体，置于4℃冰箱过夜；取出切片经PBS冲洗5 min×3次，加入生物素标记的二抗，室温孵育40 min；再经PBS冲洗切片5 min×3次，DAB显色，10%苏木素进行复染；将切片置入70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、无水乙醇梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，于光学显微镜下观察拍照。

1.2.3 免疫组化染色结果判定［9］每张染色切片结果均由两名病理医师进行结果判定。以细胞质或细胞核呈棕黄色颗粒为阳性显色。VEGFA由染色强度和阳性细胞百分比来进行评分。①细胞染色强度评分标准：0分（无染色），1分（弱阳性，浅黄色），2分（中阳性，棕黄色），3分（强阳性，棕褐色）。②阳性细胞百分比评分标准：0分（阳性细胞数＜5%），1分（5%～25%），2分（26%～50%），3分（51%～75%），4分（＞75%）。染色强度与阳性细胞百分比评分乘积为染色指数（staining index，SI），SI＜3分为阴性，SI=3为弱阳性，3＜SI＜6为中阳性，SI≥6为强阳性。本研究以阴性和弱阳性为低表达，以中阳性和强阳性为高表达。

1.2.4 随访 所有病人均有完整的随访资料，对所有治疗出院后的病人进行复查或电话随访，每月1次，随访时间为5年，末次随访时间截至2020年12月31日，统计并记录病人复发转移情况。随访期间，发生复发转移42例（复发转移组）、未发生复发转移病人53例（非复发转移组）。

1.3 统计学方法运用统计学软件SPSS 19.0对数据进行处理。计数资料以例（%）表示，采用χ2检验或校正χ2检验；计量资料以表示，采用独立样本t检验或校正t检验。采用Pearson检验分析食管鳞状细胞癌病人miR-200b-3p与VEGFA mRNA表达的相关关系；采用Kaplan-Meier法分析食管鳞状细胞癌组织中miR-200b-3p、VEGFA表达与病人复发转移的关系，采用Cox比例风险模型分析影响食管鳞状细胞癌病人复发转移的危险因素。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 食管鳞状细胞癌组织与癌旁正常组织miR-200b-3p、VEGFA表达情况比较食管鳞状细胞癌组织中miR-200b-3p表达水平明显低于癌旁正常组织（P＜0.05）；VEGFA mRNA和VEGFA阳性率明显高于癌旁正常组织（P＜0.05）。见表1，图1。

表1 食管鳞状细胞癌组织与癌旁正常组织miR-200b-3p、VEGFA表达情况

2.2 食管鳞状细胞癌病人miR-200b-3p与VEGFA mRNA表达的相关性食管鳞状细胞癌病人miR-200b-3p与VEGFA mRNA表达呈负相关（r=-0.39，P＜0.001）。见图2。

图2 食管鳞状细胞癌病人miR-200b-3p与VEGFA mRNA表达相关性

2.3 复发转移组与非复发转移组病人食管鳞状细胞癌组织miR-200b-3p、VEGFA表达情况比较复发转移组病人食管鳞状细胞癌组织中miR-200b-3p表达水平（0.53±0.14）明显低于非复发转移组（0.78±0.20）（t=6.87，P＜0.001），VEGFA阳性率［92.86%（39/42）］明显高于非复发转移组［67.92%（36/53）］（χ2=8.76，P＜0.05）。

2.4 miR-200b-3p、VEGFA表达与食管鳞状细胞癌病人临床病理参数的关系食管鳞状细胞癌组织中miR-200b-3p、VEGFA表达与病人年龄、性别、淋巴结转移、浸润深度无关（P＞0.05），与病人组织分化程度、TNM分期有关（P＜0.05）。见表2。

表2 miR-200b-3p、VEGFA表达与食管鳞状细胞癌病人临床病理参数的关系/例（%）

2.5 食管鳞状细胞癌组织中miR-200b-3p、VEGFA表达与病人复发转移的关系95例食管鳞状细胞癌病人5年内复发转移率为44.21%（42/95）。Kaplan-Meier曲线显示，miR-200b-3p低表达者5年复发转移率（55.56%）明显高于高表达者（34.00%）（χ2=4.46，P=0.035）；VEGFA高表达者5年复发转移率（55.17%）明显高于低表达者（27.03%）（χ2=7.26，P=0.007）。见图3。

图3 食管鳞状细胞癌组织中miR-200b-3p、VEGFA表达与病人复发转移的关系

2.6 影响食管鳞状细胞癌病人复发转移的危险因素单因素分析显示，组织分化程度、TNM分期、miR-200b-3p低表达、VEGFA高表达均是影响食管鳞状细胞癌病人复发转移的危险因素（P＜0.05）。多因素分析显示，组织分化程度、miR-200b-3p低表达、VEGFA高表达是影响食管鳞状细胞癌病人复发转移的独立危险因素（P＜0.05）。见表3。

表3 影响食管鳞状细胞癌病人复发转移的危险因素分析

3 讨论

食管癌是一种常见的、病死率高的恶性肿瘤，对人类生命健康造成严重威胁。我国食管癌死亡率位居第4位，其中90%是食管鳞状细胞癌，5年相对生存率低于40%。目前，组织分化程度和TNM分期是临床医师判断食管鳞状细胞癌病人预后的主要指标，但据不完全统计，当前约60%的病人临床分期与术后病理分期不符，存在一定的局限性［10］。因此寻找敏感、特异的分子预后指标，针对不同病人选择合适的个体化治疗方案，能提高远期生存率，同时还保证病人有较高的生活质量，对于临床及科学研究工作都有重大意义［11］。

VEGFA作为一种重要的血管新生诱导剂，主要生物学作用是促进血管内皮细胞增殖，诱导新生血管形成和增加血管的通透性，引起肿瘤细胞生长和转移，从而导致放疗的失败［12］。孙文泽等［13］研究表明，VEGF在食管鳞状细胞癌中高表达，并与食管鳞状细胞癌淋巴转移及TNM分期等临床病理特征密切相关。翁小坤等［14］研究表明，下调VEGFA对食管癌细胞增殖有抑制作用。此外，Shen等［15］研究指出，肌动蛋白纤维相关蛋白1-反义RNA1下调通过调控miR-498/VEGFA轴阻碍食管鳞状细胞癌细胞增殖和迁移，可作为诊断和治疗食管鳞状细胞癌的新型生物标志物。但VEGFA与食管鳞状细胞癌病人预后的关系研究较少。本研究结果显示，食管鳞状细胞癌组织中VEGFA mRNA和VEGFA阳性率远高于癌旁正常组织，其表达与病人组织分化程度、TNM分期有关，提示VEGFA可能与食管鳞状细胞癌发生、发展有一定的关联。进一步研究发现，复发转移组病人食管鳞状细胞癌组织中VEGFA阳性率远高于复发转移组，且Kaplan-Meier曲线显示VEGFA高表达者5年复发转移率远高于低表达者，提示VEGFA可能与食管鳞状细胞癌病人复发转移存在一定联系，其高表达可能对病人复发转移具有一定的提示作用。此外，Cox分析发现，VEGFA高表达是影响食管鳞状细胞癌病人复发转移的独立危险因素，提示检测VEGFA可能有利于判断食管鳞状细胞癌病人复发转移情况。

miRNA是一种非编码RNA，其主要作用是在转录或转录后水平调控基因表达。研究发现miRNA与肿瘤发生和转移均有关［16-17］。miR-200b-3p是一种研究较多的miRNA，在结直肠癌、肝细胞癌等多种恶性肿瘤中发挥抑癌作用，其高表达可抑制肿瘤发生及转移［18-19］。但miR-200b-3p在食管鳞状细胞癌发生及复发转移中的作用尚不明确。因此，本研究采用实时荧光定量PCR法检测组织中miR-200b-3p表达，结果发现食管鳞状细胞癌组织中miR-200b-3p表达水平远低于癌旁正常组织，其表达与病人组织分化程度、TNM分期有关，提示miR-200b-3p可能在食管鳞状细胞癌的发生发展中发挥重要作用，其具体的分子机制仍需进一步研究。进一步研究发现，复发转移组病人食管鳞状细胞癌组织中miR-200b-3p表达水平远低于非复发转移组，且Kaplan-Meier曲线显示miR-200b-3p低表达者5年复发转移率远高于高表达者，提示miR-200b-3p低表达可能与食管鳞状细胞癌病人复发转移有关。此外，Cox分析发现，miR-200b-3p低表达是影响食管鳞状细胞癌病人复发转移的独立危险因素，提示miR-200b-3p表达可能作为评估食管鳞状细胞癌病人复发转移的参照指标之一。

李庆贺等［7］研究报道，miR-200b-3p可通过靶向下调VEGFA表达参与胰腺癌发生、发展。但miR-200b-3p与VEGFA相互作用与食管鳞状细胞癌发生及病人预后的关系尚不清楚。本研究Pearson检验分析发现，食管鳞状细胞癌病人miR-200b-3p与VEGFA mRNA表达呈负相关，提示miR-200b-3p可能通过调控VEGFA参与食管鳞状细胞癌发生、发展，具体作用机制在今后需深入探讨。

综上所述，miR-200b-3p在食管鳞状细胞癌组织中表达下调，VEGFA表达上调，二者表达与病人组织分化程度、TNM分期有关，且二者均可能作为评估病人复发转移的临床指标。但miR-200b-3p、VEGFA在食管鳞状细胞癌发生、复发转移及预后中的具体作用机制，后期仍需进一步研究探讨。