金果胃康胶囊对PLGC大鼠Wnt/Lgr5信号通路的干预研究 *

袁敏惠*崔冰慧褚宇鹏孟凯强黄毓娟刘争辉王捷虹沈舒文

(1．陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；2．陕西中医药大学附属医院，陕西 咸阳 712000)

胃癌是我国临床常见的恶性肿瘤之一，死亡率占全球第三位[1]。一般认为是由胃癌前病变(PLGC)经历一个漫长的过程发展而来，目前现代医学尚无特效的治疗手段及药物，通过中医药的整体观和辨证论治有效干预PLGC，可以延缓，甚至阻断其向胃癌的发展，临床具有独特的疗效和明显的优势，对防治胃癌有积极意义[2-6]。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 选用4～5周龄的SPF级雄性SD大鼠(体重100～130 g)90只，由成都达硕实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(川)2015-030。

1.1.2实验药物 金果胃康胶囊由陕西中医药大学附属医院制剂中心提供(批号：20190429)；维酶素片(批号：20190104)，规格：0.2 g×100片。

1.1.3实验试剂 N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)(日本东京化学工业有限公司，编号：MO527)；盐酸雷尼替丁(货号：S67363)；4%的多聚甲醛溶液、BCA蛋白定量检测试剂盒、5X蛋白上样缓冲液、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(武汉博士德)；HE染色试剂盒、AB-PAS染色试剂盒(北京索莱宝)；水合氯醛(北京化工厂)；Loading buffer、PVDF膜(上海碧云天生物公司)；RNA提取试剂盒、cDNA反转试剂盒、荧光定量试剂盒(深圳艾伟迪)；PCR引物(生工生物工程(上海)股份有限公司)；无水乙醇；二甲苯；Wnt1、β-catenin、Lgr5、β-actin，单克隆抗体(北京博奥森)。

1.1.4仪器 5430R高速低温离心机(德国Eppendorf)；702超低温冰箱(美国Thermo)；全自动高压灭菌器(日本三洋MLS-S780)；FC3化学发光凝胶成像系统(美国Protein Simple)；CX21正置电子光学显微镜(日本OLYMPUS)；纯水机(美国Millipore)；XB100制冰机(美国Grant)；B ETS-M5脱色摇床，(江苏Kylin-bell)；R 136型石蜡切片机(德国Leica)；TK-218生物组织摊片机、烤片机(湖北泰维)；TC-120 S+型生物组织自动脱水机(湖北泰维)；C150酶标仪(美国Biotech)；荧光定量PCR仪(美国ABI 7500)；D3024R紫外分光光度计(Thermo公司)；Nano Drop2000超微量紫外可见分光光度计(赛默飞世尔科技公司)。

1.2方法

1.2.1模型建立与动物分组 采用MNNG结合浓盐水灌胃及饥饱失常等综合造模方法复制PLGC模型[7-8]。把90只大鼠正常饮食适应性喂养1 w后，随机抽取12只作为正常对照组，其余78只进行PLGC造模。分别于13、15和17 w随机抽出3只造模大鼠，取胃小弯体-窦交界处胃黏膜组织，HE染色光镜下观察胃黏膜肠上皮化生病变，实验第17 w结束确定造模成功。将造模成功的大鼠，分为模型组、金果胃康胶囊治疗高、中、低剂量组及维酶素组。

1.2.2药物干预 从造模成功的63只PLGC大鼠中随机抽取60只进行药物干预，随机分为5组，模型组、金果胃康胶囊高、中、低剂量组、维酶素组，每组12只大鼠。空白组及模型组予以生理盐水灌胃；中药高、中、低剂量组分别按照0.096 g·mL-1、0.048 g·mL-1、0.024 g·mL-1浓度灌胃；维酶素组按照0.068 g·mL-1浓度灌胃。以上灌胃均采用3mL·只-1，每日1次，灌胃治疗时间均为6 w。

1.2.3胃黏膜组织的制备[9]第23周末治疗结束时，所有大鼠禁食不禁水12 h后处死。各大鼠按照体重注射水合氯醛[0.3 mL·(100g)-1]腹腔麻醉，取全胃组织，沿胃大弯剪开，取胃小弯体-窦交界处胃黏膜组织块，用4%的多聚甲醛溶液固定，经过梯度乙醇脱水、石蜡包埋、切片等常规操作后，用于HE染色、AB-PAS染色。剩余胃黏膜组织立即放置-80 ℃冰箱中备用，用于实时荧光定量(RT-PCR)检测。

1.2.4RT-PCR法检测Wnt/Lgr5信号通路靶因子Wnt1、β-catenin、Lgr5表达水平[9-11]RT-PCR分析相关细胞因子及蛋白酶基因表达，将RNA提取后进行质量检测，在42 ℃保温15 min和95 ℃保温5 min的条件下进行cDNA反转录合成，PCR反应后检测各组大鼠胃黏膜上皮细胞Wnt1mRNA、β-cateninmRNA、Lgr5mRNA表达。用于扩增内参β-actin以及Wnt1、β-catenin、Lgr5基因的引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，设计的引物序列如表1所示。

表1 扩增的基因引物信息

以20 μL总反应体积准备反应体系。然后放入RT-PCR仪中进行检测。记录每一组样品扩增反应的Ct值，运用下述公式(2-△△Ct法)计算基因的相对表达量。

F=2-[(待测组目的基因平均Ct值-待测组内参基因平均Ct值)-(对照组目的基因平均Ct值-对照组内参基因平均Ct值)]

2 结果

2.1大鼠胃黏膜组织形态改变情况 空白组大鼠：胃黏膜光滑，呈淡红色，皱襞粗大且规整；模型组及金果胃康胶囊低剂量组大鼠：胃黏膜粗糙变薄，色泽苍白，皱襞变细且数量变少，病变处可见溃疡糜烂；金果胃康胶囊高、中剂量组及维酶素组：胃黏膜光滑程度、色泽、皱襞数量及形态介于空白组与模型组之间(详见图1)。

图1 各组大鼠胃黏膜组织形态

2.2大鼠胃黏膜病理改变情况

2.2.1HE光镜下观察 空白组：大鼠胃黏膜上皮组织腺体完整，排列整齐，边界清晰，细胞形态及大小正常，未见或极少见胃黏膜炎性细胞浸润改变。模型组：大鼠胃黏膜上皮组织腺体数量减少，排列紊乱，萎缩变薄，可见细胞间质充血、水肿，有炎性细胞浸润，可见杯状细胞和高柱状细胞形成，代表有肠化改变。中药低剂量组、中药高剂量组、维酶素组、中药中剂量组：与模型组相比，大鼠胃黏膜上皮组织腺体数目依次逐渐增加，腺体结构排列相对整齐，可见少量的炎性细胞浸润，其中中药中剂量组胃黏膜上皮好转情况最为明显(见图2)。

图2 各组大鼠胃黏膜上皮病理组织学改变(HE染色，×200)

2.2.2AB-PAS光镜下观察 空白组：大鼠胃黏膜上皮细胞分泌中性糖蛋白黏液，染色均见红色或紫红色，未见蓝染灶。模型组：大鼠胃黏膜肠上皮化生细胞分泌酸性糖蛋白黏液，可见较明显的蓝染灶。各治疗组：与模型组相比，蓝染病灶范围、染色程度均有一定减轻，但中药低剂量组减轻程度不显著，中药中剂量组减轻最为明显。说明药物干预后大鼠胃黏膜肠上皮化生的病变程度有所减轻，其中尤以金果胃康胶囊中剂量组效果最为显著(详见图3)。

图3 各组大鼠胃黏膜上皮病理组织学改变(AB-PAS染色，×200)

2.3RT-PCR法检测大鼠胃黏膜上皮细胞Wnt1mRNA、β-cateninmRNA、Lgr5mRNA基因转录情况 与空白组相比，模型组Wnt1mRNA、β-cateninmRNA、Lgr5mRNA表达量均明显升高，有统计学意义(P<0.01)。

与模型组相比，中药中、高剂量组、维酶素组Wnt1 mRNA、β-cateninmRNA、Lgr5mRNA表达量均显著下降，有统计学意义(P<0.01)。说明金果胃康胶囊能抑制PLGC大鼠胃黏膜上皮Wnt1mRNA、β-cateninmRNA、Lgr5mRNA的过度表达，且金果胃康胶囊中剂量组效果相对最佳。(详见图4，图5，图6，表2)

注：▲与空白组比较，差异有统计学意义(P<0.01)；*与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。

注：▲与空白组比较，差异有统计学意义(P<0.01)；*与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。

注：▲与空白组比较，差异有统计学意义(P<0.01)；*与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。

3 结论

金果胃康胶囊可以改善PLGC大鼠的一般情况和胃黏膜的病理变化情况。同时通过金果胃康胶囊干预后，大鼠胃黏膜的 Wnt1、β-catenin、Lgr5的蛋白表达及基因转录均明显降低，揭示金果胃康胶囊可能通过抑制细胞过度增殖，促进细胞凋亡，降低胃癌发生的可能，从而改善了胃黏膜的病理状态，达到治疗PLGC的目的。

4 讨论

4.2胃肿瘤干细胞及Wnt/Lgr5信号通路与胃癌 荷兰学者Barker等[12-16]发现Wnt通路靶因子Lgr5表达于幽口腺体底部，体内谱系追踪实验表明Lgr5+细胞可能代表了具有自我更新能力的多能干细胞，Lgr5+细胞可分化各种类型的胃黏膜上皮细胞，并产生完整的腺体。在各种刺激因素，如炎症微环境、Hp感染、理化因素等作用下，导致干细胞的错误异位，或干细胞巢与干细胞正常生理关系的素乱，或干细胞不断的基因突变累积，最终转变为肿瘤干细胞。肿瘤干细胞和干细胞存在共同调节的信号通道(包括经典Wnt，Notch，Sonic，hedgehog通道)[14-15]。

胃干细胞特异性标志物Lgr5的发现为PLGC的研究指明了方向。研究证实，在肝细胞癌、卵巢癌、食管癌中，Lgr5常过度表达，说明其在肿瘤的产生和发展中占有重要地位[15-17]。另外，Lgr5作为Wnt信号转导通路的重要视基因，Wnt信号转导通路激活后，可引起Lgr5表达水平的上调或下调现象，可能调控肿瘤干细胞增殖、分化、转移，进而在恶性肿瘤组织的发生、发展过程中发挥关键作用。近年以来Lgr5作为Wnt信号通路的重要视基因也就成为肿瘤发生、发展及治疗研究的新热点[18-20]。

4.2金果胃康胶囊组方及意义 我校沈舒文教授根据中医学理论，结合临床实践以及现代药理学研究成果，提出：PLGC的发生是由于毒与瘀交阻胃络，从而导致胃黏膜腺体萎缩、肠化增生，尤其是重度非典型增生及肠化阶段以“毒瘀交阻”证为主。并认为PLGC的高危证型是“毒瘀交阻兼见气阴两虚证”，其病机特点为“毒瘀交阻，气阴两虚”，并历经十余年研制的金果胃康胶囊，由半枝莲、枸橘、朱砂七、太子参组成，具有清热解毒、化瘀散结、滋阴益气的功效，主要针对PLGC的“毒瘀交阻兼见气阴两虚”证型，前期临床观察发现本方对于对逆转PLGC疗效显著[21-27]。

综上所述，我们在既往研究的基础之上，通过建立大鼠慢性萎缩性胃炎癌前病变模型，观察中药对于异型性细胞增殖的抑制作用，从Wnt/Lgr5信号通路探讨金果胃康胶囊干预胃癌前病变的可能作用机制，为今后癌前病变患者临床治疗提供理论与实践基础。