气调包装协同低温等离子体杀菌对狮子头保鲜效果的影响

郭依萍 李 冉 叶可萍 李仲情 陈永芳 张园园

(南京农业大学食品科技学院国家肉品质量安全控制工程技术研究中心/江苏省肉类生产与加工质量安全控制协同创新中心，江苏 南京 210095)

随着人们对高品质生活重视程度的提高，餐饮业在快节奏的生活中不断变革，以现代餐饮业与食品加工业相融合的“中央厨房”也逐渐出现在大众视野[1]。调理制品作为中央厨房生产的非终端产品[2]，主要通过适当加工后以包装或散装形式于低温条件下配送至餐馆、食堂等地进行储存、销售[3]，但由于食品本身营养物质及微生物的影响，产品货架期较短，严重制约了调理制品的市场发展。狮子头是肉丸的一种，属于淮扬菜系，具有鲜香软糯、肥瘦适中、食用方便等特点[4]，是深受广大消费者喜爱的调理肉制品之一[5]。因狮子头本身营养物质丰富，微生物极易在其表面及内部生长繁殖从而造成产品的腐败变质[6]。传统热杀菌技术，如巴氏杀菌、高温杀菌和超高温瞬时灭菌等易损害食品的营养成分及感官品质[7]。此外，市场上销售的狮子头主要采用彩袋或塑料袋等进行简单包装，不利于狮子头的贮藏销售及远距离运输流通[8]。如何在保证产品品质的前提下有效延长产品货架期，是制约狮子头市场发展尤为关键的问题。

新型非热杀菌技术，包括超高压、低温等离子体、超声等，作为目前国际食品行业蓬勃发展的加工技术，已广泛应用于果蔬、谷物、水产品、肉制品等领域[9]。肉及肉制品经非热杀菌技术处理可以有效保持产品感官及食用品质，延长其货架期[9-10]。低温等离子体(cold plasma, CP)作为一种非热杀菌技术，可以在常温下通过电离气体产生大量活性氧(reactive oxygen species, ROS)和活性氮(reactive nitrogen species, RNS)，从而抑制或杀灭产品表面的微生物[11]。与传统热处理灭菌方式相比，低温等离子体技术具有处理温度低、对营养破坏少、能最大限度保持产品品质、无毒副产品、成本低等优点[12]。由于其快速有效的杀菌特性，国内外学者已将其应用到多种食品的杀菌保鲜中，如生鲜果蔬、肉类及禽蛋制品[13]。Lee等[14]研究发现大气压低温等离子体可以在不改变即食鸡胸肉块感官特性的同时显著减少产品的细菌数量。马虹兵等[15]研究表明低温等离子可以有效杀灭橙汁和牛奶中的病原菌，且对维生素C及牛奶的氧化影响较小。气调包装(modified atmosphere packaging, MAP)通过在产品密封包装前去除周围的空气，使用理想空气(通常是混合气体而不是单一类型的气体)代替，从而达到抑制微生物生长繁殖的作用[16-17]。李冉等[8]研究表明，40%CO2+60%N2气调包装可以显著抑制狮子头中微生物的增长。汪春玲等[18]在气调保鲜的基础上结合低温等离子体复合处理保鲜罗非鱼片，发现在4℃条件下罗非鱼的贮藏期可达到18 d，等离子体处理延缓了罗非鱼的弹性骤变、挥发性盐基氮的增长及微生物的生长繁殖。李天琪[19]研究表明低温等离子体对气调包装的鱿鱼丝有明显的杀菌效果，可以在保持即食鱿鱼丝品质的同时达到减少微生物的目的。上述研究表明，低温等离子体对食品微生物有杀灭作用，与气调包装协同作用对延长产品货架期有积极作用。但目前运用低温等离子体技术对中式调理类肉制品的杀菌处理研究仍然较少，气调包装协同低温等离子体作用的保鲜效果更有待探索。基于此，本试验以狮子头为研究对象，采用40%CO2+60%N2气调包装协同低温等离子体杀菌的方式对样品进行处理，优化低温等离子体的处理时间，通过菌落总数、挥发性盐基氮(total volatile base nitrogen, TVB-N)、硫代巴比妥酸反应物(thiobarbituric acid reactive substances, TBARS)、感官评价、挥发性有机化合物等指标，探究气调包装与低温等离子体协同保鲜方式对狮子头品质及货架期的影响，旨在为狮子头保鲜技术的发展提供理论参考，并促进中式调理类肉制品市场的发展。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

狮子头产品购于江苏省苏食肉品有限公司，采样前工厂已完成对样品的微生物抽检，将采集的狮子头于3 h内用冰盒送至实验室。

平板计数琼脂(plate count agar, PCA)，北京陆桥技术股份有限公司；氧化镁、硼酸、2-硫代巴比妥酸、三氯乙酸(trichloroacetic acid, TCA)，国药集团药业股份有限公司；甲基红、溴甲酚绿指示剂，南京化学试剂股份有限公司；无菌均质袋，青岛海博生物技术有限公司；氯化钠，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

PRACTUM612-1CN分析天平，德国赛多利斯公司；SMART500气调包装机，西班牙ULMA公司；TW20恒温水浴锅，德国Julabo公司；Avanti J-26 S XP高速冷冻离心机，美国Beckman Coulter公司；Scan 1200 自动影响分析菌落计数仪、BagMixer拍击式均质器，法国InterScience公司；STARER3100型实验室pH计，上海奥豪斯仪器有限公司；Spectral Max M2e 多功能酶标仪，美国MD公司；ICP500、ICP260培养箱，德国美墨尔特公司；K1160气相离子迁移谱(gas chromatography-ion mobility spectrometry, GC-IMS)，济南海能仪器股份有限公司；SJF-H6杀菌釜，山东鼎泰盛机械科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品处理 将狮子头样品随机分为5组，进行如下处理：第1组为对照组，不做任何处理，采用原有普通彩袋包装；第2组为MAP组(40%CO2+60%N2组)，仅采用40%CO2+60%N2进行气调包装；另外3组作为低温等离子体处理组，采用上述气调包装方式的同时利用低温等离子体技术在85 kV电压下分别处理3、6和9 min，标记为MAP-3 min、MAP-6 min和MAP-9 min。在采样当天随机选取经过不同处理后的样品进行指标测定，记为第0天，其余样品置于4℃条件下贮藏，每周取样进行指标测定，直至样品腐败后停止试验。重复次数为3。

1.3.2 测定项目与方法

1.3.2.1 菌落总数 菌落总数测定参照《GB 4789.2-2016食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[20]。微生物数量表示为log CFU·g-1。细菌生长数据利用Baranyi方程拟合细菌的生长动力学模型[21-22]，并预测产品达到《NYT 2073-2011调理肉制品加工技术规范》[23]中预加热类调理肉制品中细菌总数最高限量值5 log CFU·g-1的贮藏时间。

1.3.2.2 挥发性盐基氮(TVB-N) TVB-N含量测定参照《GB 5009.228-2016食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》[24]中的自动凯氏定氮法。

1.3.2.3 硫代巴比妥酸值(TBARS) 参考曹辰辰等[25]的方法并稍加修改。取5 g狮子头样品，加入25 mL 7.5%三氯乙酸[含0.1%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)]，匀浆30 s后5 000 r·min-1离心10 min，取上清液2 mL，并加入2 mL 0.02 mol·L-12-硫代巴比妥酸溶液，95℃高温孵育30 min后取出静置冷却至室温。取上清液于532 nm波长处测定吸光度值。参考《GB 5009.181-2016 食品中丙二醛的测定》[26]中分光光度计法配制丙二醛标准系列溶液，并测定吸光度，制作标准曲线。TBARS值以每千克样品中丙二醛(malondialdehyde, MDA)的毫克数表示。

1.3.2.4 感官评定 感官评定采用《GB/T 22210-2008食品安全国家标准 肉和肉制品感官评定规范》[27]并参考张志刚等[28]的研究方法，稍作修改。将贮藏后的狮子头拿出恢复至室温后，放置于白色陶瓷板上。由5位经过培训的感官评价人员组成感官评价小组，通过触觉、视觉和嗅觉检验对肉丸的色泽、外观形态及气味进行感官评价。每次感官评定在同一环境进行，评定人员之间无交流。感官评定标准见表1。

表1 狮子头品质感官评定标准Table 1 Sensory evaluation standards of meatballs quality

1.3.2.5 挥发性有机化合物 采用GC-IMS分析狮子头中的挥发性有机化合物，参考杜超等[29]的方法并稍加修改。称取狮子头样品2 g置于20 mL顶空瓶中，磁帽密闭封口后放置在仪器进样区待测。仪器采用振荡加热方式；60℃孵育15 min；孵育转速500 r·min-1； 进样针温度85℃；进样量500 μL。

GC条件：采用FS-SE-54-CB-1型色谱柱(15 m×0.53 mm，1 μm)，柱温保持在60℃。以纯度为99.99%的氮气为载气，载气流速以2 mL·min-1保持2 min，8 min内线性增至15 mL·min-1， 10 min内增至 80 mL·min-1，15 min内增至130 mL·min-1， 最后5 min 增至150 mL·min-1。

IMS条件：漂移管温度：45℃；漂移气：N2；流速：150 mL·min-1；压力：1.381 kPa；IMS探测器温度：45℃。

1.4 数据处理

所有数据使用SAS分析软件进行分析，采用单因素方差分析，使用Duncan’s多重比较进行显著性差异分析，当P<0.05时，认为有显著性差异。使用GraphPad Prism 8软件绘图。挥发性物质使用仪器配套软件LAV(Laboratory Analytical Viewer)、GC×IMS Library Search进行定性分析，以信号峰体积表示挥发性有机物相对含量，数据以平均值±标准差形式表示。使用SPSS软件对主成分特征值进行分析。

2 结果与分析

2.1 低温等离子体处理对狮子头贮藏过程中菌落总数的影响

由图1-A可知，未经气调包装和低温等离子体处理的对照组样品初始菌落总数为4.25 log CFU·g-1。贮藏第0天，MAP组与对照组之间无显著差异，经低温等离子体处理后的狮子头菌落总数可减少0.70～1.56 log CFU·g-1，显著低于未经低温等离子体处理组。贮藏7 d时，对照组样品菌落总数达到5.31 log CFU·g-1， 超过《NYT 2073-2011调理肉制品加工技术规范》[23]中规定的预加热类调理肉制品中细菌总数最高限量值(5 log CFU·g-1)，但MAP-6 min与MAP-9 min两组的菌落总数还未达到4 log CFU·g-1， 显著低于其他处理组。贮藏14 d时，对照组样品菌落总数达6.84 log CFU·g-1，显著高于其他处理组，MAP-9 min样品菌落总数为4.91 log CFU·g-1，仍未超过调理肉制品菌落总数限量标准。随贮藏时间延长，MAP-6 min与MAP-9 min两组的菌落总数始终无显著差异。如图1-B、C所示，由Baranyi模型预测结果可知，对照组、MAP-6 min组及MAP-9 min组样品菌落总数达到5 log CFU·g-1的时间分别为7.98、14.28、14.84 d 。由此表明，气调包装协同低温等离子体处理可以有效降低狮子头产品的初始细菌总数，在一定程度上延长了狮子头产品的货架期。

2.2 低温等离子体处理对狮子头贮藏过程中TVB-N含量的影响

TVB-N是指动物性食品由于酶和细菌的作用，在腐败过程中使蛋白质分解而产生的氨以及胺类等碱性含氨物质，是表示食品新鲜度的指标[30]。由图2可知，贮藏初期，经低温等离子体处理后狮子头的TVB-N含量与对照组之间无显著差异。随着贮藏时间的延长，各组TVB-N含量不断增加，对照组的TVB-N含量显著高于其他处理组。贮藏7 d时，MAP组与低温等离子体处理组的狮子头TVB-N含量无显著差异。贮藏21 d时，对照组的TVB-N含量达到19.96 mg·100g-1， 对照组与MAP组的TVB-N含量均显著高于低温等离子体处理组。MAP-6 min和MAP-9 min两处理组的TVB-N含量在贮藏过程中均无显著差异，贮藏至28 d，TVB-N含量达到13.82～14.57 mg·100g-1。

2.3 低温等离子体处理对狮子头贮藏过程中TBARS值的影响

TBARS是脂质的氧化产物，表示产品的酸败程度。TBARS值越大，表示产品脂质氧化程度越高[5]。由图3可知，贮藏0 d时，经过低温等离子体处理后的TBARS值显著高于未经低温等离子体处理组，表明低温等离子体处理使脂质氧化的速度加快。但在贮藏14 d后，对照组的狮子头TBARS值显著高于其他处理组，MAP-6 min与MAP-9 min两组之间无显著差异。

2.4 低温等离子体处理对狮子头贮藏过程中感官品质的影响

由图4可知，贮藏前7 d，各组狮子头均可保持较好的色泽、气味等感官品质。贮藏14 d时，各组狮子头气味指标评分均有所下降，但感官品质整体仍在消费者可接受范围内，狮子头具有其特有的香气，色泽均匀有光泽，但各组微生物含量已分别超过或将要超过调理肉制品的微生物限量标准。贮藏21 d时，各组狮子头感官上才出现明显差异，对照组、MAP组及MAP-3 min组的气味评分下降至3分及3分以下，其中对照组气味劣变最明显。贮藏21 d的MAP-9 min组整体接受度为4分，达到可接受范围的最低值，其余组的狮子头评分均在4分以下，已不被消费者接受。4℃冷藏过程中MAP-6 min和MAP-9 min两组微生物数量、理化指标无显著差异，感官品质无明显不同，结合微生物数量、微生物生长动力学曲线及感官评价结果，认为MAP-6 min或MAP-9 min处理可将狮子头货架期延长7 d。

图2 不同低温等离子体处理时间对狮子头贮藏过程中TVB-N含量的影响Fig.2 Effect of different cold plasma treated time on TVB-N content of meatballs during storage

图3 不同低温等离子体处理时间对狮子头贮藏过程中TBARS值的影响Fig.3 Effect of different cold plasma treated time on TBARS value of meatballs during storage

2.5 低温等离子体处理对狮子头贮藏过程中挥发性有机化合物的影响

由感官评价结果可以发现，本试验处理的狮子头在贮藏至第21天时，感官变化最大，其中气味指标变化较明显。试验对贮藏第0和第21天的各组狮子头进行GC-IMS分析，进一步探究其挥发性化合物的组成变化。由表2可知，贮藏第0天的狮子头共定性出25种化合物，其中醇类9种，酮类6种，醛类4种，酯类3种，其他类物质3种。醇类(1-丙醇、苯乙醇等)，酮类(2-己酮、2-庚酮等)，醛类(己醛、戊醛等)及酯类(乙酸乙酯、丙烯酸乙酯等)是贮藏第0天狮子头的主要挥发性有机化合物，其中经低温等离子体处理后狮子头中的庚醇、1-己醇、1-丙醇、2-癸酮和壬醛的物质含量显著高于对照组。主成分分析(图5)结果发现，MAP、MAP-3 min和MAP-9 min组间差异较小，而MAP-6 min和其他组之间具有明显差异，但在感官上并无明显区别，可能与新鲜狮子头中强烈的香辛料气味有关。随着贮藏时间的延长，狮子头中1-己醇、正己醛、柠檬烯及2-甲基吡嗪的相对含量逐渐增加。贮藏第21天的样品共定性出26种化合物，其中正丁醛、苯甲醛、2-丁酮、柠檬烯及2-甲基吡嗪的物质含量高于贮藏第0天，对照组腐败狮子头中2-己酮、2-丁酮、苯乙烯、2-甲基吡嗪及八甲基三硅氧烷的含量显著高于其他处理组。根据图5发现，贮藏第21天对照组狮子头挥发性化合物与其他处理组相比具有明显差异，MAP-6 min与MAP-9 min两组之间主成分差异较小，MAP-3 min与MAP组之间的挥发性有机化合物主成分差异不明显，这与感官分析的结果一致。将贮藏0和21 d不同处理的狮子头样品中已定性出的物质指标构成矩阵，利用SPSS软件进行主成分分析，结果如表3所示。贮藏第0天确定主成分个数为5个，方差贡献率分别为39.71%、30.39%、8.85%、7.59%、6.38%，累计贡献率达到92.93%。贮藏第21天确定主成分个数为6个，方差贡献率分别为45.34%、18.53%、13.86%、8.21%、4.58%、3.22%，累积方差贡献率达到93.74%。经LAV软件中Dynamic主成分分析处理得到的第0与第21天的PC1与PC2累计贡献率均与SPSS软件分析结果相似，表明结果有效。

图4 不同低温等离子体处理时间对狮子头贮藏过程中感官品质的影响Fig.4 Effect of different cold plasma treated time on sensory quality of meatballs during storage

表2 不同低温等离子体处理时间对狮子头贮藏过程中挥发性有机化合物的影响Table 2 Effect of different cold plasma treated time on volatile organic compounds of meatballs during storage/(a.v.)

表2(续)

注：A：第0天主成分分析图；B：第21天主成分分析图。Note: A: The 0 d principal component analysis diagram. B: The 21 d principal component analysis diagram.图5 不同贮藏时间下狮子头挥发性有机化合物主成分分析图Fig.5 Principal component analysis of volatile organic compounds of meatballs at different storage times

3 讨论

低温等离子体激发过程中会产生大量的活性氧(ROS)和活性氮(RNS)等活性成分(reactive species, RS)[31]。ROS和RNS能够改变和降解细菌DNA等细胞成分，引起结构和功能异常，从而导致细菌死亡[32]。本研究发现，贮藏初期，经低温等离子体处理后的狮子头菌落总数可减少0.70～1.56 log CFU·g-1，显著低于未经低温等离子体处理组。王晨等[33]在低温等离子体75 kV条件下处理盐水鸭2 min后发现盐水鸭菌落总数减少1.67 log CFU·g-1，菌落总数杀菌率高达97.8%，这与本研究结果相一致。随着低温等离子体处理时间的延长，狮子头的杀菌效果更显著，这主要与等离子体产生的活性物质含量有关[34]。

随着贮藏时间的延长，大量微生物进行代谢活动，分解蛋白质，生成较多含氮物质。本研究发现气调包装协同低温等离子处理可以显著减缓狮子头中TVB-N含量的增加，MAP组的TVB-N含量始终高于低温等离子体处理组，但在贮藏过程中两种处理之间无显著差异，这表明气调包装对抑制产品中细菌及内源酶活性也有一定积极作用[35-36]。与本研究结果相似的是，乔维维[37]在低温等离子体对牛肉品质的影响研究中发现经气调包装和低温等离子体处理后的牛肉TVB-N含量增加速度显著低于未处理组，在贮藏前7 d，与单独气调包装相比，气调包装协同低温等离子体处理对延缓牛肉TVB-N值增加更显著。这可能与低温等离子体处理抑制产品中微生物活动，延缓氨及胺类等含氮化合物产生有关[38]，当与气调包装共同作用于狮子头保鲜时，抑制蛋白质分解的效果可能更加明显。

表3 主成分的特征值和贡献率Table 3 Eigenvalues and cumulative contribution rates of principal component

狮子头在经低温等离子体处理后，初始TBARS值增加，可能是因为等离子体电离气体后产生含自由基等活性物质会从脂质分子中夺走氢离子，进而引发或加速脂质氧化[39]。徐慧倩等[38]探究了低温等离子体对南美白对虾冷藏期间品质的影响，发现低温等离子体处理加速了对虾的脂质氧化，可能是由于等离子体系中产生的ROS(如单线态氧、羟基自由基)夺走脂质分子中的氢离子，促进了脂质氧化相关的自由基链式反应[40]。李欣欣等[39]通过低温等离子体处理酱牛肉后发现初期经低温等离子体处理后的酱牛肉TBARS值略高于未处理组，但贮藏后期未处理组TBARS值显著高于处理组，与本研究结果一致，这可能与等离子体中ROS寿命短[41]或低温等离子体作用于肉制品后产生亚硝酸盐，抑制脂质氧化[42]有关。

感官评价是衡量食品新鲜度的重要指标之一，其中食品气味变化在感官上最明显。肉制品中大多挥发性化合物，如醇、醛、酮及酯等物质，是由不饱和脂肪酸的化学氧化以及通过斯特勒克(Strecker)降解与蛋白质、肽和游离氨基酸的进一步相互作用产生的[43]。狮子头经低温等离子体处理后庚醇、1-己醇、1-丙醇、2-癸酮和己醛含量显著高于未处理组，这可能与狮子头中的脂肪氧化降解和不饱和脂肪酸的降解有关[44-45]。Chen等[46]研究发现火腿与空气接触后，火腿表面挥发性物质中的1-己醇含量显著高于未与空气接触的火腿。大多数醇类物质是脂质氧化分解的产物，1-己醇与棕榈酸和油酸氧化有关，1-丙醇可以由肉豆蔻酸氧化产生[47]。壬醛和己醛均是狮子头中重要的挥发性物质[48]，这两类醛类物质的阈值较低，具有清香气味。酯类物质可以通过脂肪酸和醇类物质的酶促酯化反应产生，但在狮子头中鉴定出的酯类物质种类较少。朱文政等[48]在研究不同烹制时间下狮子头的挥发性物质时鉴定出的酯类物质种类少且含量低，对狮子头的挥发性气味影响不显著。由于食品本身内源酶作用或微生物生长， 产品的挥发性化合物含量时刻会发生变化，当挥发性化合物的浓度超过可接受的阈值时，会使产品在感官上不被消费者所接受[49]。本研究中对照组腐败狮子头中的2-己酮、2-丁酮、苯乙烯、2-甲基吡嗪及八甲基三硅氧烷显著高于其他处理组，可能与脂肪和蛋白质氧化降解程度高有关，其中产生的吡嗪物质主要来源于氨基酸和还原酮的Strecker降解[50]。较短时间的低温等离子体处理对狮子头挥发性化合物影响较小，85 kV低温等离子体处理6 min或9 min条件下可以有效抑制狮子头中腐败气味的产生，这可能与低温等离子体对狮子头的杀菌作用有关。

4 结论

本研究结果表明，气调包装协同低温等离子体杀菌处理可以显著降低狮子头的初始微生物数量，延长产品货架期。低温等离子体处理对狮子头脂质氧化有促进作用，但低温等离子体处理的时间越长，对狮子头的杀菌效果越明显，可有效保持狮子头新鲜度及感官品质。低温等离子体处理会使狮子头中的庚醇、1-己醇、1-丙醇、2-癸酮及壬醛物质等挥发性有机化合物增加，2-己酮、2-丁酮、苯乙烯、2-甲基吡嗪及八甲基三硅氧烷等挥发性有机物可能是组成狮子头腐败气味的主要成分。综合各项品质指标及经济成本发现，40%CO2+60%N2气调包装协同低温等离子体处理6 min可以在显著抑制微生物生长的同时保持狮子头品质，产品货架期可达到14 d。