利用环介导等温扩增结合核酸试纸条技术快速检测粪便艰难梭菌的方法研究

骆益华 吴丽娜 吴 俊 赵 明 邵飞琴 张伟群

1.杭州市临安区第一人民医院检验科，浙江杭州 311300；2.杭州市临安区疾病预防控制中心，浙江杭州 311300

艰难梭菌实验室检测方法主要有细胞毒素中和试验（cell cytotoxicity assay，CCTA）、厌氧培养法、免疫学毒素检测包括酶联免疫分析（enzyme immunoassay，EIA）法、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）检测方法等，但是各种方法均存在一定的缺点和局限性。环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术是一种核酸扩增方法，该方法使用4 对引物检测位于tcdA5 端的6个不同保守区域，在等温条件下进行扩增，具有快速、费用低、敏感度高、特异性强、操作简便的特点。

本研究旨在研究利用环介导等温扩增（loopmediated isothermal amplification，LAMP）结合核酸试纸条技术建立一种艰难梭菌快速检测的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

采集2016 年1 月至2017 年12 月杭州市临安区第一人民医院临床感染性腹泻患者的粪便标本201份，所有粪便标本均于-80℃冷冻保存。沙门菌、副溶血性弧菌、志贺菌、致病性大肠埃希菌、创伤弧菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌共7 个菌株，均为标准菌株。

1.2 仪器与试剂

台式高速离心机（德国Eppendorf公司）；CFX-96 Touch 型实时荧光定量PCR 仪；生物安全柜（NU-543-600S）；超微量紫外分光光度计（Thermo NDONE-W）；高热灭菌器（日本松下公司）；恒温培养箱（日本松下公司）；冰箱（日本三洋公司）。LAMP脱氧核糖酸扩增试剂盒（日本荣研株式会社）；荧光目视检测试剂盒（日本荣研株式会社）；DNA Kit 提取试剂盒；溶菌酶。

1.3 方法

1.3.1 艰难梭菌的培养 取200mg 粪便样本装入1.5ml 的EP 管中，加入800μl 无水乙醇，漩涡震荡至粪便均匀分散，室温静置1h，8000 转/min 离心2min，弃上清，用500μl 0.9%（质量分数）氯化钠注射液（以下简称生理盐水）混匀后全量倒入烘烤后的艰难梭菌分离平板上（平板需提前在烘箱内烘烤40～50min），涂布直至液体收干，放入厌氧盒中37℃培养48h，挑取单菌落接种至血平板上，37℃再培养48h，保存菌株。

1.3.2 艰难梭菌DNA 的提取 取1.5ml 的EP 管，装入200μl PBS 溶液，用接种环接入足量菌，加入100μl 20mg/ml 的溶菌酶，漩涡振荡后放入55℃水浴锅孵育1h，取出EP 管，快速离心使管壁上液体回落，加入20μl 蛋白酶K，200μl 缓冲AL，混匀后56℃水浴10min，离心，加入200μl 无水乙醇，混匀15s，离心，将所有液体小心加入吸附柱，8000 转/min 离心1min，弃下管，换新的收集管，加入Buffer AW1 500μl，8000 转/min 离心1min，换新的收集管，加入Buffer AW2 500μl，14000 转/min 离心3min，换新的收集管，14000 转/min 离心1min。将吸附柱换到干净的EP 管中加入200μl 缓冲AE，室温静置1min，8000 转/min 离心1min 即得DNA 提取液（DNA 浓度用超微量紫外分光光度计测量并记录），-20℃保存备用。

1.3.3 引物的设计与合成 从美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库中获取已知的艰难梭菌基因tcdA 基因序列，选择区域分别设计LAMP 反应所需的4～6 条引物，引物由上海生工生物工程技术公司合成。

1.3.4 LAMP 扩增反应体系及引物筛选 应用LAMP 通用试剂盒检测艰难梭菌，通过比较各组引物的反应结果优劣，筛选出较好的引物组合。LAMP扩增法的反应体系为25μl：2×反应缓冲液（Tris-HCl（pH=8.8）40mmol/L，KCl 20mmol/L，MgSO16mmol/L，（NH）SO20mmol/L，Tween20 0.2%，Betaine 1.6mol/L，dNTPS 2.8mmol/L）12.5μl，Bst DNA 聚合酶 1.0μl，F3（10μmol/L）0.25μl，B3（10μmol/L）0.25μl，FIP（10μmol/L）2.25mol/L，BIP（10μmol/L）2.25μl，FIP-Bio（10μmol/L）1.75μl，LF-Fit（10μmol/L）1μl，Sterilized ddHO 0.75μl。另再加钙黄绿素指示剂1μl。将反应体系混匀后，在CFX-98 荧光定量PCR 仪上63℃等温扩增60min。根据荧光扩增曲线及颜色变化判断最终结果，出现荧光绿判定为阳性，橙色为阴性。再采用试纸条装置进行检测，观察结果。

1.3.5 LAMP 反应条件优化 反应体系根据反应温度的不同进行优化，每组反应进行3 个重复。反应温度分别设为60、61、62、63、64、65℃。

1.3.6 LAMP 检测敏感度试验 将提取的艰难梭菌DNA 模板用Sterilized ddHO 进行10 倍梯度稀释，7个梯度分别为8ng/μl、0.8ng/μl、0.08ng/μl、8pg/μl、0.8pg/μl、0.08pg/μl、8fg/μl，进行LAMP 扩增60min，用钙黄绿素目视及核酸试纸条检测，确定艰难梭菌LAMP 法的检出限。

1.3.7 LAMP 检测特异性试验 对7 种腹泻干扰菌（沙门菌、副溶血性弧菌、志贺菌、致病性大肠杆菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌）进行培养，挑取单菌落分别提取DNA，然后进行LAMP 扩增60min，用钙黄绿素目视和核酸试纸条检测，检测艰难梭菌LAMP 的特异性。

2 结果

2.1 引物筛选

按照不同引物配方及引物浓度进行LAMP 扩增。引物配方4 呈现荧光绿，核酸试纸条也呈阳性，因此艰难梭菌tcdA 最佳引物配方为配方4，见表1。

表1 扩增tcdA 基因的LAMP 最佳引物序列配方

2.2 反应温度的优化

按照不同反应温度进行扩增，结果显示，不同的温度对艰难梭菌LAMP 扩增的影响较大，扩增结果差异明显，阳性的显色结果和荧光结果一致，有荧光扩增曲线且均产生绿色荧光，与对应的荧光起峰一致。阴性未扩增，显色为无色，扩增60min 60～65℃扩增结果均可以用显色法检测。从实验荧光曲线Cq 值可知，61℃和62℃扩增时，虽然原始浓度的艰难梭菌DNA 模板更早开始扩增，但是总体来看所有稀释浓度的DNA 模板扩增曲线，不如60℃扩增效率高，显色结果也验证了这一点。65℃扩增时，稀释浓度为8pg/μl、0.8pg/μl、0.08pg/μl、8fg/μl 均未扩增，钙黄绿素显色也呈橙色，阴性，因此艰难梭菌LAMP 扩增最佳温度为60℃。

2.3 敏感度

从Ct 值来看，每稀释10 倍，分别约多出4 个、6 个、8 个、27 个循环。检测限为10倍稀释，即使模板10倍稀释（即0.8pg/μl）时，Cq 值为87.15 个循环（每个循环30s），相当于44min，所以扩增时长控制为60min 时，推测显色检测也是可行的。钙黄绿素目测法及核酸试纸条检测结果均与扩增曲线保持一致，即较早出现扩增曲线的样品呈绿色，核酸试纸条呈阳性。由敏感度实验结果可知，艰难梭菌tcdA 基因的检出限为0.8pg/μl。

2.4 特异性

在优化的LAMP 体系中对几种腹泻干扰菌进行特异性检测，只有艰难梭菌可以检测出阳性扩增，钙黄绿素目视法呈现荧光绿色，核酸试纸条也呈现出阳性，说明引物具有良好的特异性。

3 讨论

CD 是一种厌氧生长的革兰阳性梭状产毒芽胞杆菌，广泛分布于土壤、水等自然环境及人和动物的粪便中，属于条件致病菌。当人体肠道菌群失调时，艰难梭菌可大量繁殖，部分产毒性菌株通过 分泌毒素A、B 及二元毒素引起艰难梭菌感染（，CDI）及其相关性腹泻（associated diarrhea，CDAD），甚至可能发展为危及生命健康的伪膜性肠炎。毒素A 具有肠毒素和细胞毒素，可使肠壁中性粒细胞释放淋巴因子，引起黏膜炎性反应。此外，毒素A 还能抑制wnt信号通路，具有抗肿瘤作用。

然而临床上存在严重的广谱抗生素频繁使用以及不合理应用等诸多问题，使得艰难梭菌感染的暴发流行概率大大增加。因此，能否对艰难梭菌感染进行快速且特异的实验室检测，对于临床诊疗至关重要。

目前对艰难梭菌感染进行实验室检测有CCTA、厌氧培养、EIA 和PCR 等4 种方法，它们都存在一定缺陷和局限性，如CCTA 的检测结果受细胞种类的限制，操作复杂，费用高，耗时长；厌氧培养法操作相对繁琐，需时较长；EIA 敏感度差异较大，受多种条件的影响，PCR 分子水平检测方法时间长，存在假阳性的情况。

LAMP 是一种在20 世纪90 年代核酸扩增技术研究及应用基础上，逐渐被提出并广泛应用的一种新的技术，该技术利用一种链置换DNA 聚合酶（Bst DNA polymerase）在恒温条件下保温60min，即可完成核酸扩增，具有快速高效，敏感度高，特异性高，操作简单等优点，而且该技术不需要经过模板的高温变性和低温退火过程。目前用于等温扩增产物检测的方法主要有凝胶电泳、荧光染料、浊度法以及基于比色法的可视化检测方法等。其中，凝胶电泳检测操作繁琐，持续时间较长，效率低；荧光法检测需要特殊、昂贵的光学仪器；浊度法和比色法虽然用肉眼能够观察，但因观察者的主观判断差异容易产生误差，而且对核酸扩增效率要求较高，并不适用于所有的恒温扩增检测，且仪器昂贵，也不适于现场检测。本研究中针对艰难梭菌tcdA 基因核苷酸序列设计6 条特异性引物，建立了一种针对艰难梭菌tcdA 的LAMP 检测方法。将LAMP 法结合核酸试纸条技术，60℃扩增1h，DNA检出限为0.8pg/μl，敏感度高，速度快；在对1 株艰难梭菌和7 株非艰难梭菌进行核酸检测中，只有艰难梭菌阳性，证明设计的引物具有良好的特异性。

LAMP 结合核酸试纸条技术不需要复杂的仪器，只需在恒温条件下进行扩增，再结合核酸试纸条的检测，无需开盖引起气溶胶污染，也不用辨别颜色差异，操作简便，耗时较短。本研究建立的艰难梭菌LAMP 扩增结合核酸试纸条检测方法1h 完成反应，具有可视化、敏感度高、特异性强、方便快捷和污染少等特点，适用于粪便中艰难梭菌的快速检测，适用于基层医院现场快速检测及应用。