单细胞测序技术在儿童肝母细胞瘤中的应用前景

郭敬杰，王建尧，王斌（通信作者）

1.中国医科大学深圳市儿童医院，广东 深圳 518026；2.深圳市儿童医院 普外科，广东 深圳 518026

0 引言

肝母细胞瘤（hepatoblastoma，HB）作为儿童期最常见的原发性肝脏恶性肿瘤之一，占5岁以下儿童肝脏肿瘤的90%以上，占儿科肿瘤的1%，发病率为1.2～1.5/百万儿童[1]。近年来随着早产儿和低体重婴儿存活率增加，HB的发病率有所增加。HB患儿一般表现为较大腹部包块和异常增高的甲胎蛋白水平，患儿出现明显的临床症状一般较晚，肿瘤体积一般较大，大部分患儿错过了一期手术切除的机会，目前的诊疗方案主要是新辅助化疗联合化疗后手术切除。

目前对HB研究主要认为Wnt/β-连环蛋白信号通路在肿瘤的发生发展中起到重要作用，在HB中β-连环蛋白的突变率高达50%～90%[1-2]。HB的DNA显示全局低甲基化，伴随着特异性肿瘤抑制基因的高甲基化也是研究的热点内容[3]。在肿瘤发生发展中，肿瘤微环境会发生变化，其中免疫细胞会出现急剧的变化。单细胞测序可以在细胞层面进行研究，对不同细胞类群的变化、基因表达的上下调非常敏感，探究免疫逃逸发生的机制，可以为免疫靶点治疗提供指导。

1 ScRNA-seq在肿瘤中的应用

自从2009年，Tang等在Nature Methods杂志上发表关于ScRNA-seq的文章，ScRNA-seq广泛应用于各种动植物、微生物的研究，实现了组织到细胞的飞跃，目前scRNA-seq也提升到了三代测序，广泛应用于各种研究，比如了解肺癌患者和结直肠癌患者肿瘤微环境特征、乳腺癌免疫细胞表型在肿瘤微环境中的特征、肾癌细胞的特征、产前诊断等[4]。

目前应用ScRNA-seq在HB中的实例很少，有研究前景；例如Bondoc等通过对肿瘤组织、背景肝脏、患者来源的异种移植物（PDX）进行单细胞测序对比研究，清晰鉴定了不同来源的细胞类群。PDX中鉴定出肿瘤驱动细胞簇（Tr2）以及肿瘤维持细胞群（Tr0、Tr3、Tr5和Tr4/1），在未来可能应用于控制肿瘤生长[5]。

2 ScRNA-seq技术

ScRNA-seq不同于传统的测序技术，传统的测序技术也可以实现对基因表达量的研究，是对总体样本的研究，无法实现异质性研究。而ScRNA-seq是对单个细胞层面的研究，包括基因组、转录组、表观遗传学等方面，可以精确分析每一个细胞的变化，同时随着测序技术的提升，基因表达量的获取也越来越多，广泛应用于各个方面。ScRNA-seq的步骤大致包括：分离单细胞、制备乳浊液、破乳、扩增序列、测序及分析[6]。

ScRNA-seq首先需要制备细胞悬浮液，之后进行细胞计数和细胞活率检测，将制备好的细胞悬浮液利用微流控芯片，将带有细胞标签序列（cell barcode）的胶珠（bead）和细胞包裹在液滴中，构成了油包水的结构，将细胞裂解，使得细胞中的mRNA与bead上面的cell barcode相连，形成Single Cell GEMs（Gel Bead-in-Emulsions），在液滴中进行逆转录反应，进行cDNA的文库构建。

通过文库序列上的cell barcode可以区分目标序列来自哪一个细胞，通过序列上的UMI可以区分来源于哪个DNA分子。scRNA-seq的测序信息能反映出细胞间基因表达差异。通过特殊barcodes对同一个细胞的转录本进行标记，使得扩增之后也可以准确区分每一个细胞的单细胞信息。UMI标记每一个细胞当中的每一个转录本，每个DNA分子都有自己的UMI序列，一个UMI对应了一种DNA，在PCR扩增的时候产生的多个reads兼并成一个原始的cDNA分子，可以在很大程度上纠正扩增造成的结果偏倚[7]。

ScRNA-seq获得每一个细胞的表达量信息之后需要进行质控，目的是去除不合理的测序细胞。

（1）低质量的细胞或空的液滴中含有基因较少。

（2）细胞双重态或多重态检测到异常高基因。

（3）线粒体基因占比较高的细胞。

质控后的数据进行主成分分析（PCA），根据主成分结果选择细胞类群；通过细胞的markgene对细胞进行聚类分析和细胞类别的鉴定，不同样本的对比分析，可以实现细胞异质性研究，即使不同类群的细胞也可以在同一层面进行研究，从单细胞水平获得基因的表达谱，揭示特定的生物学过程和疾病发生过程的分子调节机制[8]。

3 单细胞测序技术在研究肿瘤的发生发展及肿瘤微环境方面的优势

3.1 研究肿瘤的异质性，探讨肿瘤发生发展规律

Wu等通过对42个晚期非小细胞肺癌肿瘤活组织进行scRNA-seq，鉴定出以往研究不同的细胞类型，例如滤泡树突状细胞和辅助性T细胞17细胞，来自不同患者的肿瘤组织在细胞组成、染色体结构、发育轨迹方面具有较大的异质性，同时揭示了异质性与肿瘤相关嗜中性粒细胞的关系[9]。为了研究乳腺癌原位肿瘤组织和转移肿瘤组织中肿瘤细胞拷贝数变异（CNV）差异，Gao等应用单细胞测序技术发现大量的CNA在肿瘤进化的早期短时间内获得，并且随着肿瘤克隆扩张而保持高度稳定，克隆多样化发生在肿瘤进展的最早阶段，产生一个或多个克隆稳定扩增，符合“大爆炸”模型；同时揭示了乳腺癌的发展过程，转移灶是经过淋巴和血道转移形成的[10-11]。

3.2 描述肿瘤免疫微环境，寻找免疫治疗靶点

ScRNA-seq全面地展现了肿瘤微环境中各组成部分的特有特征，并明确肿瘤细胞与微环境各组分之间的相互作用，尤其是肿瘤与免疫细胞的关系，有助于探索肿瘤免疫治疗的潜在新靶点。肿瘤相关巨噬细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞等细胞亚群构成了肿瘤免疫微环境；这些免疫细胞不仅发挥着肿瘤细胞的杀伤作用，同时又促进肿瘤进展、免疫逃逸[12]。抗体阻滞细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4（CTLA-4）、程序性死亡受体-1（PD-1）等免疫治疗的药物就是解除CD8+T细胞免疫抑制的靶向药物，黑色素瘤、淋巴瘤、Merkel细胞癌等肿瘤对靶向治疗药物反应良好，但是对有些肿瘤效果不佳，如卵巢癌、胰腺癌等，我们还需要进一步对肿瘤的免疫微环境进行研究，找到每个肿瘤特异的治疗靶点。为了解肝癌患者肿瘤微环境的特征，Zheng等对5063个人类肝癌T细胞进行了scRNA-seq，通过转录组数据进行细胞分类，发现了大量功能紊乱的杀伤性CD8+T细胞和抑制性T细胞存在于肿瘤细胞内，同时基因Layilin对CD8+T细胞的杀伤功能有抑制作用，可能成为潜在免疫治疗靶点[13]。

3.3 突破样本量的限制，实现信息最大化

ScRNA-seq可以突破样本量的限制，如超声引导下穿刺样本、外周血循环肿瘤细胞等都是应用最小的样本实现最大化。外周血循环肿瘤细胞（CTCs）是从原发或继发肿瘤病灶脱落进入外周血的肿瘤细胞[14]。有观点认为其具有在远处器官启动肿瘤生长的能力，传统的方法无法实现对脱落肿瘤细胞的研究，而单细胞水平的研究可以实现。D_Avola等通过单细胞测序检测到肝癌患者血液中的CTCs，CTCs中表达的基因[长非编码RNA（HULC）、SPINK1，IGF2]是肝癌中的特异基因，也说明其来源于肝癌组织；CTCs高表达IGF2，20% 的早期肝癌患者也高表达IGF2。该研究基于单细胞技术对肝癌患者CTCs的研究，发现了潜在生物标志物IGF2，为肝癌患者的诊断提供参考[15]。

4 展望

HB是一种原发于肝脏的实体恶性肿瘤，近年来发病率有所增加。目前的主要治疗方法包括化学疗法、手术切除和肝移植，高危患儿的预后不佳。目前尚缺乏有效的免疫及靶向治疗方案，对于肿瘤的发生发展过程以及免疫机制等都不太清楚。ScRNA-seq作为一项细胞水平的技术，可以实现肿瘤异质性的研究以及肿瘤微环境的探索，其在实体肿瘤中的广泛应用证明了研究前景，应用此项技术研究HB是可行的，将来我们可能找到精准的免疫及靶向治疗方案，为HB患儿带去希望。