不同植物提取物对黄酒中有害成分的抑制

王晓雨 田润刚,2 杨 国 韩雪源,2

(1.绍兴文理学院 生命科学学院，浙江 绍兴 312000；2. 绍兴市黄酒质量安全与清洁生产重点实验室；绍兴黄酒酿造技术传承与创新平台，浙江 绍兴 312000)

引言

黄酒是中国传统酒类饮品，在世界三大酿造酒中占有重要的一席.其酿酒技术独树一帜，是东方酿造界的典型代表.黄酒中含有丰富的营养物质，享有“液体蛋糕”的美誉，并且具有一定的保健功能[1].黄酒中富含氨基酸、糖类、维生素以

及硒、锌、铁、铜等多种人体必需的微量元素.此外，黄酒中特有的酚类物质、活性肽及功能性低聚糖等均有不同程度的保健作用，因此黄酒在很大程度上满足了人们对酒精饮品营养价值及养生保健方面的需求[2].

然而，黄酒中依然存在一些具有健康隐患的危险物质.例如，高级醇是黄酒产生香气物质和适宜口感的主要成分，但过多的高级醇不仅影响黄酒的口感和品质，而且对人体会产生一定的毒害作用[3].此外，氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate，简称EC)是一种已知的致癌物和诱变剂.与其他酿造酒相比，黄酒中的EC含量相对较高[4-5].同时，在后期的成品黄酒中，尿素将与黄酒中的乙醇发生缓慢反应产生EC，因此尿素也是黄酒安全生产的隐患和危险物质之一.甲醇既是酒的芳香成分，也是有害成分，具有较强毒性，而且容易在体内大量积累，难以及时排出，对身体损害大，尤其是对人体血管、神经系统的麻痹作用较大[6].

Zhou等[7]研究表明，竹叶提取物对黄酒酿造体系中EC含量具有抑制效果，并且推测竹叶酚类物质在其中发挥重要作用.酚类物质富含于覆盆子提取物、火棘提取物、竹叶提取物和沙棘提取物中，是提取物的主要成分.因此，本研究尝试将以上四种植物提取物分别添加于黄酒酿造过程中，通过对酿得酒样的EC含量、甲醇含量、尿素含量和高级醇含量以及植物提取物的总酚含量进行比较分析，探索不同植物提取物的添加对黄酒中有害物质含量的影响.

1 材料与方法

1.1 黄酒发酵

将1.5 kg熟糯米、1.25 L蒸馏水、1.5 g黄酒酵母、 225 g麦曲和0.25 g乳酸链球菌素加入5.0 L的发酵容器中，环境温度为28 ℃，发酵4～5天.之后设置温度为18 ℃，进行后发酵.在发酵第三天分别加入浓度为500 mg/L的覆盆子提取物、500 mg/L火棘提取物、500 mg/L竹叶提取物和500 mg/L沙棘提取物.以未添加植物提取物的发酵组为对照组.发酵期间，每2天用Erma手持折射仪(SDR-500)测定白利糖度(°Brix).待后发酵完成后，将酒样进行压榨、澄清.

1.2 酒精度测定

采用蒸馏法测定酒精含量[8].量取100 mL的酒液加入 Gibertini DEEPV(Super DEE，GIBERTINI，意大利)快速蒸馏仪器中，蒸馏后，使用Gibertini Densimat/Alcomat2(AlcoMat-2，GIBERTINI，意大利)酒精度测定仪，测定酒精含量.

1.3 氨基甲酸乙酯含量测定

参考谭文渊等[9]，采用高效液相色谱(HPLC)法测定黄酒中的氨基甲酸乙酯含量.并用不同浓度EC标准溶液制作峰面积-浓度标准曲线，进一步对酒样中EC含量进行相对定量.

详细分析参数如下：流动相， 乙腈：水=80∶20(体积比)； 流速0.8 mL/min； 检测波长215 nm；柱温20 ℃；进样量20 μL.用量筒准确量取30 mL待测酒样于球型滴液漏斗中，用3 mL正己烷溶液活化氨基柱，调节漏斗开关，缓慢将30 mL酒样通过活化好的氨基柱，再将5 mL甲醇/乙酸乙酯(2/3，体积比)溶液淋洗萃取柱后，用8 mL甲醇/乙酸乙酯(2/3，体积比)溶液洗脱萃取柱，将淋洗液和洗脱液合并装入圆底烧瓶中，在旋转蒸发仪中蒸干，用乙腈定容至2 mL，待HPLC分析.

1.4 高级醇含量测定

通过气相色谱仪对酒样中的高级醇含量进行分析[10]，以各种高级醇标准液为参照，通过制作峰面积-浓度标准曲线，进一步对酒样中各高级醇含量进行相对定量.详细分析参数如下：色谱柱为DB-WAX毛细管柱(30.0 mm×0.25 mm ID，0.25 μm)；进样量：1 μL；分流比：10∶1；线速度：24.9 cm/sec；色谱柱流量：0.94 mL/min；总流量13.4 mL/min；气化室温度：250 ℃；检测器温度：250 ℃.升温过程：初始温度50 ℃，恒温1 min后以5 ℃/min升温至90 ℃，再恒温1 min后以15 ℃/min升温至230 ℃，再恒温3 min.

1.5 甲醇含量测定

采用品红-亚硫酸法对酒样中的甲醇含量进行测定[11].

1.6 尿素含量测定

采用二乙酰一肟方法对酒样中的尿素含量进行测定[2].

1.7 植物提取物总酚含量测定

四种植物提取物过80目筛，分别称取5.0 g于锥形瓶中，加入50 mL色谱级甲醇，放置于超声提取器中提取45 min(40 ℃，350 W)，提取完成后，于4 ℃冷冻离心10 min(8 000 rpm)后取上清液，重复上述过程三次.合并提取液经真空旋转蒸发去除溶剂，用甲醇定容至25 mL.于4 ℃低温冰箱中保存备用.在整个实验过程中注意避光操作.

采用Folin-Ciocalteu法测定植物提取物中总酚含量，以没食子酸为标准品.准确吸取不同浓度没食子酸标准品溶液和多酚提取液各0.1 mL于具塞试管中，依次加入7.9 mL蒸馏水，0.5 mL Folin-Ciocalteu试剂，混匀后反应5 min，加入20%(w/v)Na2CO3溶液1.5 mL，暗处反应2 h后于765 nm处测定吸光值.总酚含量表示为mg GAE/ 100g dw (干重)[12].

1.8 统计分析

所有实验进行三次生物学重复.实验结果用平均值加上或者减去标准差(±SD)表示.采用SPSS 25.0软件进行差异显著性(Duncan检验)分析，在0.05水平上，用不同小写字母表示差异显著性.并采用SPSS 25.0软件进行Pearson相关性分析，在0.05水平(双尾)上，用“*”表示显著性相关.

2 结果

本研究中所酿造酒样的乙醇含量(%(v/v))如下：对照组17.94±0.311%、覆盆子组16.25±1.103%、火棘组16.90±1.530%、竹叶组17.93±0.773%、沙棘组17.50±0.277%.覆盆子组和火棘组的酒精含量略低于其他三组.各组样品均有较高的酒精含量，说明试验具有较好发酵效率.

2.1 不同植物提取物对EC含量的影响

通过不同浓度EC标准液的HPLC分析如图1(a)所示，得到峰面积与浓度标准曲线(y=38 971x-6 550，R2=0.999 4)，进一步结合样品液相色谱EC峰面积(图1(b)),计算得到各组酒样中EC含量(表1).结果显示，覆盆子组的EC含量(21.942±6.895 μg/L)最低，而竹叶组的EC含量显著高于其他组.

(a)EC标准液液相色谱图

表1 酒样中EC、甲醇、尿素含量

2.2 不同植物提取物对甲醇含量的影响

对黄酒而言，酿酒原料中含有的果胶质是甲醇生成的基础，它主要集中在原料的表皮，例如米麦的表面.由表1可知，对照组甲醇含量(0.537±0.252 mg/L)最高， 而覆盆子组的甲醇含量(0.289±0.088 mg/L)最低，显著低于对照组.

2.3 不同植物提取物对尿素含量的影响

如表1所示，与对照组相比，试验组尿素含量均有所降低，并且覆盆子组、火棘组、竹叶组酒样中尿素含量显著低于对照组，其中覆盆子组尿素含量最低(21.183±2.365 mg/L).

2.4 不同植物提取物对高级醇含量的影响

黄酒中高级醇含量过高会破坏其风味的协调性，甚至会对人体造成危害.在本研究中，通过气相色谱法对黄酒中的高级醇进行分析，由图2可得各高级醇出峰时间，顺序依次为：正丙醇5.208 min、异丁醇6.307 min、正丁醇7.648 min、异戊醇8.947 min、正戊醇10.020 min、苯甲醇18.045 min、苯乙醇18.343 min.与对照组相比，所有试验组中异丁醇、苯乙醇含量均有所降低，其中火棘组异丁醇含量显著低于其他组.火棘组和沙棘组酒样中除正戊醇外，其他高级醇含量均低于对照组，且火棘组中异戊醇含量最低.同时，火棘组的高级醇总含量最低(表2).

图2 高级醇标准液气相色谱图

表2 酒样中的高级醇含量

2.5 相关性分析

对植物提取物的总酚含量进行测定，结果如表3所示， 其中竹叶提取物的总酚含量最高(0.410±0.013 mg GAE /100 g)，其次是覆盆子提取物(0.265±0.011 mg GAE /100 g).对植物提取物总酚含量与酒样有害物质含量进行相关性分析，Pearson相关性分析显示，植物提取物的总酚含量与酒样尿素含量呈显著负相关性，酒精含量与EC含量呈显著正相关性(图3).

图3 植物提取物总酚含量与酒样中有害物质含量的相关性分析

表3 植物提取物的总酚含量

3 讨论

黄酒的酿造过程中会产生或引入一些不利于人体健康的物质, 如EC、 高级醇、 甲醇、 尿素等，这些有害物质在一定程度上影响了黄酒的品质，制约其产业发展[13].研究显示，酚类物质的添加有助于降低黄酒中有害物质含量[4,14-15].植物提取物中富含大量酚类物质，是一种高效的天然抗氧化剂，能有效预防高血脂、高血糖、心脑血管疾病、肿瘤等慢性疾病，广泛应用于食品加工领域[16-17].因此，本研究在前人研究基础上，尝试在黄酒发酵过程中分别添加覆盆子提取物、火棘提取物、竹叶提取物和沙棘提取物，探索其对黄酒有害成分含量的抑制.结果表明，植物提取物对黄酒部分有害成分的产生具有一定抑制效果，并根据相关性分析推测植物提取物中的酚类物质可能起到重要作用.

EC，被国际癌症研究机构列为可能令人类患癌的物质，其产生途径主要是氨甲酰化合物-乙醇途径，比如尿素-乙醇反应、瓜氨酸-乙醇反应、氨甲酰磷酸-乙醇反应.本研究表明，添加覆盆子提取物降低了黄酒中的EC含量.这与Zhou等[7]的研究结果相类似，竹叶提取物的添加降低了酒体中EC含量.周万怡[18]研究显示，添加没食子酸和原儿茶酸能显著抑制单酵母发酵黄酒中EC的形成，而添加竹叶提取物可以抑制传统黄酒酿造体系中EC的形成.本研究中，竹叶提取物总酚含量最高，高于覆盆子提取物，然而覆盆子组的EC含量低于竹叶组.韩煜[19]研究表明覆盆子中所含多酚成分主要为没食子酸.因此，推测由于竹叶和覆盆子提取物中单体酚类如GC、PC等含量不同而导致上述EC含量和酚类总含量趋势的不一致.相关性分析显示，植物提取物的总酚含量与酒样尿素含量呈显著负相关性.尿素是发酵酒类饮料中最主要的EC前体物，黄酒中EC有90%来源于尿素与乙醇反应[18].据此推测植物总酚含量应与EC含量也呈现负相关性，然而本研究中的相关性分析并未得到此结果，因此植物总酚含量与黄酒中EC含量的相关性有待进一步探究.

黄酒中高含量的高级醇类是引起上头的主要因素，且黄酒中高级醇含量远远高于其他酿造酒[20].但是高级醇也是黄酒的主要风味物质，是酿造过程中不可避免的副产物.有研究表明，采用低产高级醇的酵母进行发酵，能够降低高级醇含量[21-22].也有研究显示，添加谷氨酸会显著影响发酵果汁的发酵过程，对荔枝酒中高级醇生成量有明显的抑制作用[23].在本研究中，添加火棘提取物和沙棘提取物使酒样中的大部分高级醇含量有所降低.

黄酒是富含营养价值的低度饮料酒，符合现代人由高度酒向低度、营养型酒转化的消费趋势.因此，对黄酒中具有安全风险的物质进行研究并降低其含量，对提升黄酒的品质具有重要意义.

4 结论

本研究通过在发酵过程中分别添加覆盆子、火棘、竹叶和沙棘植物提取物，探究植物提取物对黄酒中有害成分含量的影响.以添加的不同植物提取物作为影响因素，以酒样中EC含量、甲醇含量、尿素含量和高级醇含量为测量指标，进行单因素试验.结果表明添加覆盆子提取物对酒样中EC、甲醇和尿素含量具有显著抑制作用；其次，火棘提取物和沙棘提取物的添加对酒样中高级醇的含量具有较好的降低效果.关于以上植物提取物的添加对黄酒中有害物质含量影响的原理，有待于进一步研究.