急性心肌梗死患者血浆microRNA与cTnI、H-FABP的相关性及其潜在诊断价值

于 叶 ，赵瑞平 ，李 萍

(1.包头医学院，内蒙古 包头014060；2.包头市中心医院心内科)

根据世界卫生组织报告显示，心血管疾病是世界范围内死亡的主要原因。而急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)则是全球范围内发生的最严重心血管疾病之一。因此，早期和及时的诊断对控制AMI的发展和进行适当的治疗以降低发病率和病死率至关重要。现今，临床上诊断AMI依据患者的症状、心电图特征性改变以及生物标志物水平。由于诊断依据的特异性具有一定的限制，因此不能有效充分地早期诊断AMI。所以，在时间窗内寻找更敏感、更特异、更有针对性的诊断标志物用于AMI的早期诊断迫在眉睫。

MicroRNAs(miRNAs)是存在于物种中具有高度保守性的小型非编码 RNA(ncRNAs)，主要通过信使 RNA (mRNA)的翻译抑制或降解来调节基因表达[1]。因此，测定和比较正常及病理状态下miRNAs的表达含量对疾病的研究有重要意义。现今，已经有研究证实了miRNAs在癌症中具有双重功能，特别是在乳腺癌中，miRNA主要作用是参与肿瘤的进展和转移，因为它们被认为是肿瘤的抑制因子或是致癌基因；更重要的是，miRNAs可作为乳腺癌早期诊断及预后的生物标志物，与此同时还可为乳腺癌护理治疗靶点提供新的认识[2]。也有研究表明miRNAs参与心血管疾病的病理生理过程[3]。例如miRNA-221-3p参与动脉粥样硬化的发病机制，与心血管疾病发生发展相关[4]。迄今为止，关于 miRNA在AMI中的研究报道了miRNA-208和miRNA-499在AMI后上调[5]，但miRNA-221-3p在AMI后变化规律尚没有明确结论且相关的研究较少。因此，本研究采用高通量测序，主要目的是探讨miRNA-208a-3p、miRNA-499a-5p和miRNA-221-3p三种miRNAs单独及联合在AMI中的潜在诊断价值，从而为AMI早期诊断提供新的潜在的生物标志物，同时也能为AMI患者提供个性化的治疗方案，降低急性心肌梗死的危险性及病死率。

1 对象与方法

1.1对象 连续性收集选取2018年11月—2020年12月就诊于内蒙古包头市中心医院心内科诊断为急性心肌梗死患者52例为AMI组，另选取非心源性胸痛患者24例为对照组。依据欧洲心脏病学会发布的第4版心肌梗死全球统一定义诊断AMI[6]。纳入标准:(1)胸痛发作6 h内入院；(2)胸骨后疼痛时间>30 min；(3)含服硝酸酯类药物后胸痛症状持续不缓解；(4)心电图特征性改变(典型的心肌缺血征象)；(5)心肌损伤标志物升高。排除标准:(1)既往MI；(2)肺栓塞、主动脉夹层等引起的胸痛；(3)先天性心脏病、心肌病、心脏瓣膜病、心源性休克；(4)近6个月有卒中史；(5)患有严重疾病(如恶性肿瘤)或内分泌代谢紊乱、急性感染、血液系统疾病；(6)肝肾功能不全。本研究经包头市中心医院医学伦理委员会批准，患者及其家属知情同意。

1.2方法

1.2.1样品制备 所有受试者于入院时于肘前静脉抽取2份外周静脉血(各5 mL)置于抗凝的EDTA真空管中。一份用于检测心肌损伤标志物：肌钙蛋白I(cTnI)、心肌脂肪酸结合蛋白(H-FABP)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)等；一份用于总RNA提取。

1.2.2心肌损伤标志物检测 室温20～25 ℃下，将抽取的外周静脉血经过3 500 r/min离心10 min，取100 μL上层血浆与150 μL样本稀释液于2 mL EP管中充分混匀，取混合物100 μL加入检测卡加样孔。室温放置15 min，将检测卡放入上转发光免疫分析仪(北京热景生物技术股份有限公司)中进行测量。

1.2.3总RNA提取及高通量测序 室温20～25 ℃下，经过1 500 r/min离心10 min，提取1 000 μL上层血浆，置于1.5 mL RNA(RNase-free)离心管中提取RNA，在-80 ℃冰箱中包装保存。通过Agilent 2100 Bioanalyzer 检测总RNA的浓度和纯度，并采用Illumina公司的TruSeq Small RNA Sample prep Kit进行小RNA文库构建。然后依次通过PCR扩增富集文库、凝胶电泳纯化文库、Agilent High Sensitivity DNA Kit对文库质检、Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit对文库定量，最后通过Illumina平台上机测序。

2 结果

2.1两组一般资料比较 共纳入76例研究对象，AMI组52例，对照组24例，两组在年龄、性别、体质指数(body mass index，BMI)、吸烟史、饮酒史、高血压病史、糖尿病病史、总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesferol，HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesferol，LDL-C)差异均无统计学意义(P>0.05)。AMI 组中的肌红蛋白(myohemoglobin，MYO)、心肌肌钙蛋白I(cardiac Troponin I，cTnI)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme MB，CK-MB)及心肌脂肪酸结合蛋白(cardiac fatty acid binding protein，H-FABP)水平均高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 研究人群的临床特征比较

2.2三种miRNAs在两组中表达水平比较 与对照组相比，AMI 组患者血浆miRNA-208a-3p、miRNA-499a-5p和miRNA-221-3p的表达水平明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 三种miRNAs在两组中表达水平比较

2.3AMI 组中三种miRNAs表达水平与cTnI、H-FABP的相关性

2.3.1三种miRNAs与cTnI的相关性 AMI组中，血浆miRNA-208a-3p、miRNA-499a-5p和miRNA-221-3p与cTnI的相关分析结果发现，三者与cTnI水平均有一定程度的正相关关系(P<0.05)。见表3。

表3 AMI 组中三种miRNAs表达水平与cTnI的相关性

2.3.2三种miRNsA与H-FABP的相关性 AMI组中，血浆miRNA-208a-3p、miRNA-499a-5p和miRNA-221-3p与H-FABP的相关分析结果发现，三者与H-FABP水平均有一定程度的正相关关系(P<0.05)。见表4。

表4 AMI 组中三种miRNAs表达水平与H-FABP的相关性

2.4三种miRNAs对AMI早期诊断的潜在价值分析 血浆miRNA-208a-3p、miRNA-499a-5p和miRNA-221-3p及三者联合对AMI诊断的ROC曲线结果显示：miRNA-208a-3p (0.794，95 %CI: 0.695-0.893)、miRNA-499a-5p (0.772，95 %CI: 0.661-0.884)、miRNA-221-3p (0.806，95 %CI: 0.710-0.901)以及三者联合(0.862，95 %CI: 0.780-0.944)，三者联合诊断AMI的AUC均高于三种miRNAs单独诊断AMI的AUC。结果提示，miRNA-208a-3p、miRNA-499a-5p和miRNA-221-3p三者具有一定早期诊断AMI的潜力，且联合指标早期诊断AMI的潜在价值更高。见表 5，图 1～4。

表5 三种miRNAs单独及联合对AMI的诊断情况

图1 hsa-miR-208a-3p对AMI诊断的ROC曲线分析

图2 hsa-miR-499a-5p对AMI诊断的ROC曲线分析

图3 hsa-miR-221-3p对AMI诊断的ROC曲线分析

图4 三者联合对AMI诊断的ROC曲线分析

3 讨论

AMI是冠状动脉血管病变最严重的表现形式。在多数情况下，AMI是由于易损性动脉粥样硬化斑块破裂或冠状动脉内皮被侵蚀所致[7-8]。临床上，肌钙蛋白I(cTnI)、心肌脂肪酸结合蛋白(H-FABP)等一些来自循环系统的生物标志物被广泛应用于AMI的临床诊断。H-FABP主要存在于心脏，当心肌细胞发生缺血损伤时，H-FABP会迅速释放到血液中，之后由肾脏排出[9]。因此，测定血清H-FABP的表达水平可在一定程度上反映心肌损伤情况。cTnI被认为是诊断AMI的金标准[10]，但在许多非急性冠状动脉综合征(ACS)患者中也可以释放表示急性或慢性心肌损伤肌钙蛋白，包括严重的心力衰竭或房颤[11]，甚至甲状腺功能减退、败血症性休克、慢性肾衰竭等情况[12]。而H-FABP的特异性不如cTnI检测高，因为特异性有一定限制，所以它们不能充分有效诊断AMI。

理想的AMI生物标志物应容易获取、并且具有高度的可预测性及可靠性，检测方法应快速、灵敏、准确。样本必须采用最小的侵入性方法获取且容易获取，例如血浆、血清和尿液，而且在血液循环中生物标志物要具有相对较长的半衰期，以此来确保检测的可预测性。miRNAs具有组织或细胞特异性，在体内可以调节多种生理和病理过程，且miRNAs已经被认为是某些疾病的生物标志物，例如肿瘤患者血液循环中的miRNA可用于诊断和预后[2]，因为它们在血液和其他体液中是稳定的。如今在分子和遗传水平寻找新的潜在的生物标志物仍在研究中。高通量测序技术作为一种能够检测整个转录组表达水平的研究方法，将基因组学研究带入了一个新的时代。

本文选取了miRNA-208a-3p、miRNA-499a-5p和 miRNA-221-3p三种miRNAs进行研究，结果发现AMI组人群的血浆中这三种miRNAs的表达水平明显高于对照组，且与cTnI 和H-FABP水平均有一定程度的正相关关系；三者单独及联合诊断AMI的AUC较高，同既往的研究基本一致。表明了在AMI 发生后，三者在循环血液中的表达量增加，在心肌组织缺血损伤后很早就释放到血液循环中。近年来，越来越多的研究表明血浆miRNAs 在 AMI 的发生发展中起着重要作用。一项文献报道了AMI患者的心肌组织中表达miRNA-1、miRNA-133a、miRNA-208 和 miR-499，并且AMI患者的血浆中这些miRNA的表达水平明显升高，从而显示出这些 miRNAs 有可能成为诊断AMI新的潜在的新生物标志物[5]。也有文献报道miRNA-208和miRNA-499在AMI患者血浆中的表达水平升高，且具有较高的敏感性和特异性;二者均可作为诊断心肌梗死的生物标志物[13]。另一项研究表明AMI患者的血浆miRNA-499表达水平在入院后显著高于不稳定型心绞痛患者和健康对照人群，这项重大发现进一步证明了miRNA-499可能是诊断AMI有价值的生物标志物。此外，也有文献报道AMI患者中血浆miR-221-3p 的表达水平增加，且与肌钙蛋白及左心室收缩功能呈显著相关性，因此具有早期预测AMI的潜力,可能是早期诊断AMI的有效生物标志物[14]。本研究结果表明，AMI组中血浆miRNA-208a-3p、miRNA-499a-5p、miRNA-221-3p表达水平较对照组明显升高，且三种miRNAs与cTnI、H-FABP呈一定正相关；在早期诊断AMI时，三者单独早期诊断AMI的AUC分别为0.794、0.772、0.806，三者联合早期诊断AMI的AUC为0.862，进一步证实了血浆miRNA-208a-3p、miRNA-499a-5p、miRNA-221-3p可作为早期诊断急性心肌梗死的潜在生物标志物,且联合指标的潜在诊断价值更高。

本研究仍有一定的局限性，一是样本的数量相对较少而且具有一定的地域性，缺乏对总体的代表性；其次，miRNAs随着心肌梗死的发生及进展呈动态变化，应在不同的时间段检测miRNAs的表达水平，在后续的研究中应尽可能连续、动态地检测miRNAs的表达水平。