沼液替代化学氮肥对滨海稻田土壤有机氮和细菌群落的影响

李 瑞，张 巡，杨 阳，汤逸帆，申建华，韩建刚*

[1 南京林业大学生物与环境学院, 江苏南京 210037；2 南京林业大学江苏省南方现代林业协同创新中心,江苏南京 210037；3 中粮家佳康(江苏)有限公司, 江苏东台 224200]

近年来，关于长期和不合理施用化肥导致作物产量不稳定[1]、土壤板结[2]、酸化[3]、养分利用率低[4]等问题已有诸多报道。而沼液由于富含氮素等营养成分[5]，且重金属污染风险低[6-7]，已成为最具潜力的化学氮肥替代品，在农田得到广泛应用。研究表明，沼液替代化肥可显著提升作物产量[8]，同时可改善土壤结构和提高土壤持水性能[9]，提高土壤有机质含量和氮素等养分含量[10]。

土壤有机氮(SON)是土壤氮素的主要存在形式，占土壤全氮(TN)的90%以上[11]。可分为酸解氮(THN)与非酸解氮(NHN)两大部分[12]，酸解氮易矿化，能为当季作物供应无机氮[13]。非酸解氮难矿化，是维持土壤氮库稳定性的保障[14]。由于绝大部分SON矿化后才可被微生物和植物吸收利用[15]，所以矿化作为SON参与氮素循环的重要途经，一直是土壤氮素研究的焦点。研究表明，SON矿化过程不仅与土壤pH[16]、有机碳含量[17]等土壤性状密切相关，同时受肥料施用种类和施用量[18]等管理措施的影响。SON矿化过程主要受土壤细菌群落的驱动[19]，一些研究认为SON矿化主要与芽孢杆菌(Bacillus)[20]、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)[17]等密切相关；并且证实，长期的不同施肥措施(如化肥和有机肥施用)会引起土壤微生物活动和群落发生变化，从而影响SON的矿化过程[21]。尽管沼液中的氮素主要以无机氮为主，但由于同时含有大量、小分子有机物、矿质离子等组分[22]，因此，长期大量施用必定会通过对养分离子、pH以及微生物等直接或间接的影响，进而对SON组分及矿化过程产生影响[23]。然而，目前有关沼液施用对SON的影响及其机理的相关认识仍不明确，尤其有关沼液替代化肥措施下，土壤细菌群落是否发生改变，如何改变，以及这些变化与SON矿化之间的关系仍需进一步探讨与深入研究。

本研究以沼液广泛应用的江苏滨海稻田为对象，设置4个不同沼液替代化肥水平处理，通过对比不同水平沼液与化肥配施模式下SON矿化和SON组分变化的差异，结合微生物群落结构与多样性分析，探讨沼液替代化学氮肥对SON矿化的影响及其微生物学机理，为沼液应用过程中对土壤氮素的高效管理与调控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

研究区位于江苏省东台市弶港镇黄海原种场(32°38'26″N，120°54'15″E)。气候属于暖温带与亚热带过渡区，季风显著，年均日照时间2231.9 h，年均气温15.0℃，降水量1061.0 mm。该区域农田为滨海盐碱地改良而成，属粉砂质壤土，砂粒、粉粒和黏粒含量分别为36.2%、56.7%和7.1%。试验样地布设前，土壤pH为8.28，土壤电导率(EC)为102 μS/cm，土壤有机碳(SOC)、全氮(TN)、全磷(TP)和全钾(TK)含量分别为4.58、0.48、0.6和16.92 g/kg。

1.2 试验设计与样品采集

于2017年6月布设田间小区试验。在总氮量225 kg/hm2(该水平为当地常规用量)水平下，设置沼液提供0 (BS0)、33% (BS33)、66% (BS66)和100%(BS100)的氮4个处理，每个处理3次重复，共12个小区，各小区完全随机排列，各小区间垒土埂，并铺设防渗布进行隔离。

供试沼液取自中粮肉食(江苏)有限公司黄海沼气站。沼液pH为8.47，全氮、含量分别为1.06、0.90 g/L，有机碳含量为1.55 g/L。作物种植实行稻麦两熟制度，水稻、小麦采用当地常用品种淮稻5号、扬麦16号。参照当地耕作习惯，两季作物种植期沼液及尿素均按基肥、分蘖肥和穗肥2∶1∶2的比例进行分期施用，种植方式及其他管理同于当地。

于2019年10月水稻计产收获完成后，在各小区随机3点采集0—20 cm土层土壤进行混合，每个样品3个重复。所采土壤样品一部分置于-80℃冰箱保存，用于土壤细菌群落的测定，另一部分在室内风干后过2 mm筛，用于土壤理化性质的测定。

1.3 测定方法

1.3.1 土壤有机氮(SON)矿化的测定 SON的矿化测定采用间歇淋洗淹水培养法[24]。称取10.00 g过2 mm筛风干土样置于100 mL离心管中，加入25 mL去离子水形成稳定淹水层，在30℃下培养，分别在培养的第 0、7、14、21、28、42、56、84、112 天进行淋洗，每次淋洗后取上清液通过AA3流动分析仪测定含量，其中第0天淋洗还需测定含量。SON矿化符合一级动力学模型[25]，模型公式及其积分形式如下：

1.3.2 土壤有机氮组分测定 SON各组分采用Bremner法测定[12]，其中，酸解氮(THN)采用6 mol/L HCl酸解—蒸馏法测定；酸解铵态氮(AN)采用MgO蒸馏法测定；酸解铵态氮(AN)与氨基糖态氮(ASN)之和采用磷酸盐-硼酸缓冲液(pH 11.2)蒸馏测定；氨基酸态氮(AAN)采用茚三酮氧化、磷酸盐-硼酸缓冲液蒸馏测定；非酸解氮(NHN)、氨基糖态氮(ASN)、酸解未知态氮(UN)由差减法求得。

1.3.3 土壤细菌群落结构与多样性的测定 采用16S rDNA高通量测序技术进行土壤细菌群落的测定。使用E.Z.N.A ® Soil DNA Kit试剂盒(Omega Biotek, Norcross, USA)对0.5 g解冻后的土壤样品进行总DNA提取，DNA的提取质量检测由琼脂糖凝胶电泳完成，同时使用紫外分光光度法进行定量。使用引物341F (5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3')与805R (5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3')对细菌16S rDNA基因的V3～V4区域进行PCR扩增[26]。PCR扩增产物的验证由2%琼脂糖凝胶电泳完成。AMPure XT beads (Beckman Coulter Genomics,Danvers, MA, USA)和Qubit (Invitrogen, USA)分别用于PCR产物的纯化与定量。随后通过Illumina NovaSeq平台进行测序，通过Divisive Amplicon Denoising Algorithm进行“去重复”(相当100%相似水平的聚类)[27]，随后构建类OUTs表[28]，最终生成Feature特征表以及特征序列。物种α多样性的计算由QIIME2平台完成。

1.3.4 土壤其他性状指标的测定 土壤pH使用pH计(雷磁PHSJ-5)测定(水土比 2.5∶1)；土壤电导率(EC)用电导率仪(FE30 Plus)测定(水土比 5∶1)；土壤有机碳(SOC)使用TOC分析仪(耶拿multiN/C 3100)测定；土壤全氮用凯氏法测定[29]；土壤全磷用钼锑抗分光光度法测定[30]；土壤全钾用火焰光度法测定[31]。

1.4 数据分析

使用Origin 2017软件进行绘图以及SON矿化数据的一级动力学模型拟合。使用SPSS 23软件进行统计分析，其中单因素方差分析和Duncan法多重比较用于检验各处理SON组分、矿化参数以及作物产量等指标的显著性。采用冗余分析(Redundancy analysis，RDA)探究不同SON组分及土壤氮矿化势(N0)与相对丰度在1%以上的土壤细菌属间的关系。

2 结果与分析

2.1 不同沼液替代水平对土壤有机氮矿化的影响

如图1所示，随着培养时间的延长，不同处理累计氮矿化量逐渐增长并达到平稳，各处理培养前14天累计氮矿化量占到112天的89.0%～94.5%。采用式(2)一级动力学模型对SON矿化累积量随时间的变化进行拟合，分别计算土壤氮矿化势(N0)和矿化速率常数(k0)，结果如表1。随沼液替代水平的提高，土壤N0显著升高(P＜0.05)，与BS0处理相比，BS33、BS66、BS100处理土壤N0升高幅度分别为26.5%、39.7%、42.2%，但BS66与BS100处理间差异不显著。培养前14天的矿化速率也表现为随沼液替代化肥水平的增大而提升，BS0、BS33、BS66、BS100处理的均值分别为2.17、2.68、2.88、3.06 mg/(kg·d)，但BS66与BS100处理间差异不显著。因此，不同沼液替代水平下SON矿化能力表现为BS100和BS66处理大于BS33和BS0处理。

图1 土壤有机氮矿化曲线Fig.1 Mineralization curve of soil organic nitrogen

表1 土壤有机氮矿化拟合参数Table 1 Fitting parameters of soil organic nitrogen mineralization

2.2 不同沼液替代水平对土壤有机氮组分的影响

如图2所示，不同SON组分受沼液替代化肥水平影响。与BS0处理相比，3个不同沼液替代处理的酸解氮(THN)、非酸解氮(NHN)、氨基酸态氮(AAN)含量均显著增加(P＜0.05)，增加幅度分别为8.0%～23.0%、46.9%～73.9%和25.6%～39.2%。其中THN、AAN和氨基糖态氮(ASN)含量以BS66处理的增加幅度最高，较BS0处理分别增加21.8%、39.2%、40.9%。而NHN含量则以BS100处理增加幅度最高，较BS0处理增加幅度达73.9%。对于酸解铵态氮(AN)含量，BS33和BS100处理均显著高于BS0处理，但BS33、BS66和BS100 3个处理间无明显差异。酸解未知态氮(UN)含量则表现为仅BS100处理较BS0处理差异显著。

图2 土壤有机氮组分含量变化特征Fig.2 Change in soil organic nitrogen fractions

如图3所示，BS0处理下，SON各组分占比大小顺序为AAN＞AN＞UN＞NHN＞ASN，占比分别为26.9%、25.2%、24.4%、16.7%、6.7%。与BS0处理相比，BS33处理下AAN和NHN占比的上涨幅度分别为11.3%、28.3%，而UN占比下降幅度为26.6%，BS66处理下AAN、ASN和NHN占比均有所上涨，涨幅分别为11.6%、13.0%、11.4%，AN占比下降12.5%，BS100处理下AN和AAN占比分别下降12.5%、4.5%，NHN占比上涨32.3%。BS100处理下SON各组分占比大小顺序为AAN＞UN＞NHN＞AN＞ASN。

图3 土壤有机氮组分占比Fig.3 Proportion of soil organic nitrogen (SON) fractions

2.3 不同沼液替代水平对土壤细菌群落结构与多样性的影响

各处理土壤中，共检测到13个菌门，其中Proteobacteria (变形杆菌门)、Acidobacteria (酸杆菌门)、Chloroflexi (绿弯菌门)和Actinobacteria (放线菌门)为相对丰度较高的4类群，占细菌总丰度的70%以上(图4)。其中，沼液处理下有3个土壤细菌菌门的相对丰度发生显著变化(P＜0.05)，分别为Chloroflexi(绿弯菌门)、Actinobacteria (放线菌门)、Nitrospirae(硝化螺旋菌门)。Chloroflexi与Actinobacteria的相对丰度均以BS100处理最高，分别为13.5%、7.4%。而Nitrospirae (硝化螺旋菌门)则以BS0处理最高，比BS100处理高25.8%。

图4 不同处理下土壤细菌门相对丰度Fig.4 Relative abundance of soil bacterial phyla as affected by biogas slurry treatment

以相对丰度≥1%或者＜1%作为某一菌属新增或者消失的标准，与BS0处理比较，BS33处理新出现了2个细菌属(Subgroup_7_unclassified、Desulfarculaceae_unclassified)，同时消失了2个细菌属(Anaeromyxobacter、Betaproteobacteria_unclassified)，这4个细菌属的相对丰度总和为4.58%，占BS0处理主要细菌属相对丰度总和的11.87%；BS66处理新出现了3个细菌属(Subgroup_7_unclassified、RB41、TRA3-20_unclassified)，同时消失了3个细菌属(Anaeromyxobacter、Betaproteobacteria_unclassified、Ellin6067)，这6个细菌属的相对丰度总和为6.59%，变动比例为17.07%。BS100处理下新出现4个属(Actinobacteria_unclassified、Haliangium、S085_unclassified、Subgroup_7_unclassified)，同时4个细菌属消失(Alphaproteobacteria_unclassified、Anaeromyxobacter、Betaproteobacteria_unclassified、Ellin6067)，这8个属的相对丰度总和为8.70%，变动比例为22.54% (表2)。这说明沼液的施用水平影响了土壤细菌属的组成。

表2 土壤主要细菌属的数量与相对丰度变化Table 2 Changes in the number and relative abundance of the main bacterial genera in soil

其中，Subgroup_6_unclassified的相对丰度随着沼液替代化肥水平升高，呈现逐渐上升的趋势，Subgroup_17_unclassified的相对丰度呈下降趋势，而KD4-96_unclassified则表现为在低沼液用量BS33处理下被抑制(其相对丰度较BS0处理下降25.4%)，在BS66与BS100处理下被促进的现象(其相对丰度较BS0处理分别上涨11.1%、43.4%)。此外，在沼液替代化肥模式下，细菌属Subgroup_7_unclassified的相对丰度增加到1%以上，而Anaeromyxobacter、Betaproteobacteria_unclassified与Ellin6067的相对丰度则下降至低于1% (表3)。不同沼液替代水平的土壤细菌群落的α多样性变化差异不显著，各处理的Shannon指数处于10.799～11.056，Simpson指数处于0.9985～0.9991。

表3 各处理中几个细菌属的变化Table 3 Changes in several bacterial genera in each treatment

2.4 土壤有机氮组分及氮矿化势与细菌群落结构与多样性的关系

采用冗余分析(RDA)对不同SON组分及土壤N0与相对丰度在1%以上的土壤细菌属的关系进行分析，结果如图5所示。第1排序轴的解释量为45.03%，第2排序轴的解释量为32.75%，前两轴的解释量达到77.78%，表明前两轴能较好地解释SON组分及土壤N0与相对丰度在1%以上的土壤细菌属的关系。从图上可以看出Subgroup_10、Haliangium、Burkholderiaceae_unclassified、Steroidobacteraceae_unclassified和Subgroup_6_unclassified与SON组分及土壤N0的变化呈正相关。Spearman相关性分析结果显示，土壤N0与Thermodesulfovi brionia_unclassified呈极显著负相关性(P＜0.01)，非酸解氮与Subgroup_6_unclassified呈显著正相关(P＜0.05)，与Betaproteobacteria_unclassified呈显著负相关(P＜0.05)，氨基酸态氮与Proteobacteria_unclassified、氨基糖态氮与KD4-96_unclassified呈显著正相关(P＜0.05)，酸解未知态氮与Desulfarculaceae_unclassified呈显著负相关(P＜0.05)。

图5 SON组分及土壤N0与优势细菌属间的冗余分析Fig.5 Redundancy analysis (RDA) on soil dominant bacteria genus constrained by SON fractions and soil N0

3 讨论

3.1 不同沼液替代水平对土壤有机氮矿化及作物产量的影响

土壤有机氮(SON)矿化不仅与水分[32]、温度[33]、盐分[34]等因子密切相关，同时易受施肥影响[35-37]。本研究中，与单施化肥相比，沼液替代化肥不同水平(33%、66%和100%)均显著提升了土壤氮矿化势(N0)、SON矿化速率和累计矿化量。当沼液替代化肥水平为66%时，土壤N0达到44.76 mg/kg，较单施化肥显著升高了39.7%，同时，培养前14天的SON矿化速率达到2.88 mg/(kg·d)，累计矿化量也提高了1.4倍；但当沼液替代化肥水平升高至100%时，对SON矿化的促进作用与66%替代水平处理并无显著差异。这表明，在相同施氮量下，一定比例沼液与化肥配施可以显著提升土壤氮素的周转效率和土壤的供氮能力。这可能主要是由于沼液中有机质及养分含量高，含有多种生物有效性成分，激发土壤微生物活性，进而影响SON矿化[38]。本研究所证实的沼液替代化肥对SON矿化的促进作用与以往稻田长期施用猪粪等常规有机肥的研究结果一致，如施氮量为90 kg/hm2条件下有机肥(猪粪)与化肥配施较单施化肥的矿化速率显著提高，累计氮矿化量提高可达86.5%[36]；当有机肥替代60%化肥时土壤N0显著高于单施化肥处理[37]，可见对SON矿化的促进程度，还与有机肥类型及施用量等有关。

相比长期施用化肥处理会导致土壤质量退化[39]，降低水稻田的土壤肥力和降低产量，本研究结果显示不同沼液替代化肥水平下对水稻产量均有提升作用，仅施化肥处理下水稻产量为4560.05 kg/hm2，而沼液66%替代化肥处理下产量高达6329.18 kg/hm2，增幅最高，与仅施化肥处理相比提高38.8%。这可能与该处理下SON矿化量增加和氮供应能力增强有关。对土壤N0与水稻产量进行Pearson相关性分析，结果显示二者呈极显著相关(P＜0.01)，以往研究结果中，冬小麦、夏玉米的产量与土壤净矿化量也呈现极显著相关[40]。有机肥与化肥配施作为提高土壤N0的有效手段，进一步使作物产量也得到提升[41-42]。这表明，作物产量与SON矿化能力息息相关，沼液一定比例替代化肥可以显著提升SON矿化强度，增加作物产量。因此，应提倡沼液合理替代化肥，既可减少化肥的施用，还可增加产量。

3.2 不同沼液替代水平对土壤有机氮组分的影响

有机肥配施化肥同样会对SON各组分的含量产生影响，由于SON组分之间的矿化难易程度不同，所以SON组分含量的差异也会影响土壤氮素矿化。在本研究中，与仅施化肥相比，沼液化肥配施条件下土壤酸解氮和非酸解氮含量均有所提升，这可能是由于沼液本身富含有机物和养分，一方面直接增加了土壤中易矿化氮库和难矿化氮库的库容，另一方面为氮的释放提供了更加有利的条件，从而促进了土壤有机氮矿化，这与以往对常规有机肥施用的研究结果[43-45]一致，但土壤酸解氮中各组分对不同比例沼液替代化肥的响应有所差异。在土壤酸解氮中，沼液替代化学氮肥处理，氨基酸态氮与氨基糖态氮的含量有显著增加，并均以沼液66%替代化肥处理(BS66)的增加幅度最高，分别较化肥处理(BS0)增加39.2%和40.9%；而对于酸解铵态氮含量，施用沼液的处理(BS33和BS100)均显著高于BS0处理，但BS33、BS66、BS100 3者间无明显差异；酸解未知氮含量则表现为仅100%沼液施用处理(BS100)较BS0处理差异显著。这说明，沼液替代化肥更有利于土壤中氨基酸和氨基糖态氮库的提升。这可能是由于土壤中微生物对沼液施加带来的有机物质较为敏感[46]，提升了微生物的活性，微生物在分解有机物质与腐殖化过程中，形成了更多的易矿化态氮[47]。

3.3 不同沼液替代水平对土壤微生物群落结构的影响及其与土壤有机氮矿化和组分的关系

施肥措施会通过改变土壤物理、化学和生物学特征，驱动土壤微生物群落的演变。本研究发现，微生物无论在门或属水平上，其相对丰度均受沼液替代化肥水平的影响。沼液替代化肥氮的比例在66%以上时，Chloroflexi (绿弯菌门)、Actinobacteria(放线菌门)的相对丰度均增高，而Nitrospirae (硝化螺旋菌门)相对丰度则有所下降。这可能与Chloroflexi (绿弯菌门)更适应厌氧富氨环境有关[48]。而Actinobacteria (放线菌门)被证实在参与土壤有机质的转化过程中同时分泌抗菌物质，可以增加土壤健康程度[49]。Nitrospirae (硝化螺旋菌门)在仅施化肥处理下相对丰度最高，这与以往研究结果[50-51]一致。属水平上，施用沼液处理下(33%～100%沼液比例)相对丰度≥1%的细菌属新增了Subgroup_7_unclassified，而Anaeromyxobacter(厌氧粘细菌)与Betaproteobacteria_unclassified的相对丰度下降至1%以下；Ellin6067则在仅施化肥和沼液替代33%处理下其相对丰度≥1%，而随着沼液替代化肥比例升至66%以上时，其相对丰度下降至1%以下。这表明沼液的施用对细菌属Subgroup_7_unclassified有明显的促进作用，而对Anaeromyxobacter、Betaproteobacteria_unclassified和Ellin6067具有明显的抑制作用。其中，Anaeromyxobacter(厌氧粘细菌)一般广泛分布于厌氧沉积环境中[52]，有研究[53]表明，稻田长期施用猪粪或秸秆与化肥条件下其丰度会显著增加，这与本研究的结果相反，可能主要与沼液偏碱性有关。同时，Ellin6067为有害菌群[54]，其相对丰度的下降也说明沼液替代化肥66%以上时，可在一定程度上提升土壤质量。

土壤微生物数量和群落结构的变化是影响SON矿化和各组分变化的关键因素[55]，但同时受不同施肥措施(施肥量、肥料类型)的影响。二者相互影响并存在紧密相关的关系。本研究采用RDA对土壤N0及不同SON组分与相对丰度在1%以上的土壤细菌属的关系进行分析，结果表明在沼液施用条件下，Thermodesulfovibrionia_unclassified对土壤供氮能力的提升有一定的抑制作用，而Betaproteobacteria_unclassified、Proteobacteria_unclassified和KD4-96_unclassified具有促进作用，更利于易矿化氮库容的增加，Subgroup_6_unclassified则更有利于增加土壤氮库的稳定性。土壤微生物群落结构的变化明显受不同施肥措施的影响。有研究表明，不同化学氮肥梯度下氮矿化速率主要与Alphaproteobacteria和Gammaproteobacteria呈正相关[56]。而猪粪或秸秆与化肥混施条件下，氮矿化速率主要受unclassified Comamonadaceae和Bacillus丰度的影响，而二者均呈负相关[17]。土壤微生物群落结构和功能微生物数量对不同施肥措施响应的差异，可能主要由施肥导致的反应底物及土壤理化性质的差异所决定[53]。

4 结论

1)沼液替代化肥可显著提升土壤氮矿化势(N0)，当沼液替代水平高于66%时，土壤氮矿化势较化肥处理显著增加39.7%～42.2%，土壤的供氮能力最强。

2)沼液替代化肥显著提升了土壤有机氮(SON)中的酸解氮(THN)、非酸解氮(NHN)和氨基酸态氮(AAN)含量，不仅提高了土壤有机氮对作物的有效性，还提高了土壤氮库的稳定性，尤其以沼液替代66%的化肥效果最大。

3)施用沼液改变了土壤微生物群落结构与功能微生物的数量。随着沼液替代化肥比例的升高，Actinobacteria (放线菌门)与Chloroflexi (绿弯菌门)的相对丰度显著上升，而Nitrospirae (硝化螺旋菌门)的相对丰度却显著下降(P＜0.05)；细菌属Subgroup_7_unclassified的相对丰度明显增加，而Anaeromyxobacter、Betaproteobacteria_unclassified与Ellin6067的相对丰度则明显下降。

4)细菌属Thermodesulfovibrionia_unclassified、Subgroup_6_unclassified、KD4-96_unclassified、Proteobacteria_unclassified与SON矿化及组分变化关系密切，其相对丰度分别与土壤氮矿化势(N0)、非酸解氮(NHN)、氨基糖态氮(ASN)和酸解未知态氮(UN)呈显著相关。