植物氮素吸收利用相关NPF基因家族研究进展

王化敦，张 鹏*，马鸿翔

（1 江苏省农业科学院 / 江苏省农业生物学重点实验室，江苏南京 210014；2 扬州大学农学院 / 江苏省粮食作物现代产业技术协同创新中心/江苏省作物基因组学与分子育种重点实验室，江苏扬州 225009）

氮(N)作为生物大分子如核酸、蛋白质的基本组分，是植物生长发育需要量最多的矿质营养元素，也是大多数农业生态系统中作物产量的限制因子[1]。在通气土壤中，不同形态的人工合成氮肥在微生物(主要是硝化细菌)作用下转变为硝态氮(NO3--N)，成为无机态氮素的主要存在形式[2]；在淹水条件下，作物(如水稻)根系通过泌氧和根系分泌物形成的根际微环境可将不同形态氮转化为硝态氮，亦是植物利用的重要氮素形态[3]。

目前，植物中已报道参与硝态氮吸收和运输的转运蛋白基因家族包括：NPF(nitratetransporter1/peptidetransporterfamily)、NRT2(nitratetransporter2)、CLC(chloridechannels)和SLAC1/SLAH(slowanion channel-associated1homologues)[4-6]。在以上4个基因家族中，NRT2、CLC和SLAC1/SLAH家族成员数量较少(5～7个)，其中NRT2家族编码高亲和力(highaffinity)转运蛋白，与伴侣蛋白NAR2 (nitrate assimilation related protein)结合，在对低氮环境的响应中具有重要功能[4]；CLC家族编码氯离子(Cl-)通道蛋白，后来发现与在液泡中的储存和运输有关[7-8]；SLAC1/SLAH家族编码一类对电压反应迟缓类型(slow type)的离子通道，通过向保卫细胞运输Cl-和引发气孔闭合过程，其家族成员SLAH3主要在中柱表达，可特异性转运，与在根与地上部之间的长距离运输有关[9-10]。

NPF家族包括NRT1(nitratetransporter1)和PTR(peptidetransporter)两类基因，前者一般认为编码低亲和力(low-affinity) NO3-转运蛋白，后者编码寡肽转运蛋白[11]，由于二者序列相似性较高，在进化关系上处于同一分支，将NRT1/PTR基因统一命名为NPF(NRT1PTRfamily)[12]。研究表明，NPF基因除了作为硝态氮转运蛋白或寡肽转运蛋白转运和寡肽之外，还可转运其它多种底物(、Cl-、生长素、脱落酸、赤霉素、茉莉酸、硫代葡萄糖苷、砷酸二甲酯等)，参与多种生物与非生物胁迫响应[13-14]。与其它转运蛋白家族相比，NPF家族成员众多，模式植物拟南芥含有53个NPF基因，粮食作物水稻、玉米和小麦中分别含有93、79和331个NPF基因[12,15-16]。近年来，NPF基因的功能获得了较多关注和深入研究，模式植物拟南芥中已有超过一半(31/53)NPF家族成员的生物学功能被解析，粮食作物水稻中亦有16个NPF基因的生物学功能被报道(表1、图1)。大量研究表明，NPF基因广泛参与植物对氮素的吸收和利用过程，在改良和提高作物氮素利用率及产量相关性状中具有重要作用和应用价值。本文主要针对模式植物拟南芥和粮食作物中已报道NPF基因在氮素吸收利用中的生物学功能进行综述，以期深入理解植物高效吸收和利用氮素的机理，为提高作物氮素利用率相关研究以及作物氮高效育种实践提供参考。

图1 模式植物拟南芥和粮食作物中NPF基因在参与利用中的功能Fig.1 Diverse functions of NPF genes in nitrate utilization in Arabidopsis and main food crops

表1 模式植物拟南芥和主要粮食作物中已报道生物学功能的NPF基因Table 1 Functionally characterized NPF genes in Arabidopsis and main food crops

续表1 Table 1 continued

续表1 Table 1 continued

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1 模式植物拟南芥中NPF基因在氮素吸收和利用中的生物学功能

1.1 参与氮素吸收与外排

AtNPF6.3(NRT1.1/CHL1)是植物中第一个被克隆的硝态氮(NO3--N)转运蛋白基因，主要在根中表达，受诱导表达显著上调[48]。AtNPF6.3兼具低亲和力、高亲和力(即dual-affinity)吸收特性，由其第101位苏氨酸(Thr)是否磷酸化决定[98]。蛋白晶体结构分析表明，当环境中浓度充足时，AtNPF6.3中Thr101去磷酸化形成二聚体，降低了蛋白结构的灵活性，对具有低亲和力吸收特性；当环境中缺乏时，Thr101磷酸化使AtNPF6.3由二聚体解离为单体，提高了蛋白结构的灵活性，对具有高亲和力吸收特性[99-100]。不同于AtNPF6.3，AtNPF4.6(AtNRT1.2)仅编码低亲和力转运蛋白，参与吸收过程[36]。AtNPF4.6主要在根毛和根表皮细胞组成型表达，并且在atnpf6.3中抑制AtNPF4.6的表达进一步降低了对的吸收，说明AtNPF6.3介导的诱导型双亲和力吸收功能和AtNPF4.6介导的组成型低亲和力吸收功能相对独立[36]。植物对的获取是根中吸收与外排活动的综合结果[101]。AtNPF2.7(NAXT1)主要在成熟根的皮层细胞表达，其表达受到转录后水平的调控，当环境酸化引起细胞质pH降低时，AtNPF2.7在蛋白水平表达显著增加，参与根中的外排[21]，这一生理活动可能反映了植物对外界环境变化(胁迫)的适应性。此外，NPF基因家族部分成员编码寡肽转运蛋白(peptide transporter，PTR)，参与植物对有机态氮素的吸收过程，如atnpf8.1(ptr1)在以寡肽为氮源的培养基上生长时吸收的氮素显著降低[71]。

1.2 参与氮素在营养器官中的运输和分配

NPF基因亦参与在地上部不同组织器官中的运输和分配过程。AtNPF6.3在气孔保卫细胞中亦有较强表达，atnpf6.3在含培养条件下气孔开放受阻，这一现象与脱落酸(abscisic acid)对气孔开放的抑制作用和细胞内CO2水平无关，研究发现atnpf6.3中保卫细胞浓度显著降低，诱导的去极化现象消失，说明AtNPF6.3通过向保卫细胞运输参与了气孔活动[50]。AtNPF6.2(AtNRT1.4)主要在叶柄中表达，对维持叶片内部(叶柄、叶脉及叶片部位)的动态平衡具有重要作用，该基因突变导致叶柄中浓度显著降低，而叶片中浓度显著升高[46]。与幼嫩叶片(新叶)相比，成熟叶片因表面积较大具有较强的蒸腾作用，可以从蒸腾作用驱动的木质部流中获取更多，而发育中的幼嫩叶片(新叶)相比成熟叶片需要更多的氮素供应，AtNPF1.1(AtNRT1.12)和AtNPF1.2(AtNRT1.11)共同参与了这一生物学过程，二者主要在叶片主脉韧皮部伴胞表达，并且在成熟叶片中的表达量较高，同位素示踪试验发现双突变体atnpf1.1atnpf1.2中直接由根转运而来的15更多流向已经成熟的叶片而非新叶[17]。当外界供应不足时，体内贮藏的有效动员和再分配对于植物体生长尤其是幼嫩组织的发育具有重要作用，AtNPF2.13(AtNRT1.7)参与此生物学过程，该基因主要在老叶叶脉韧皮部细胞表达，并受氮饥饿诱导表达上调，突变导致老叶中浓度显著增加，而老叶韧皮部伤流液和新叶浓度显著降低[29]。进一步研究发现，AtNPF2.13的表达受miR827-NLA模块的调控，NLA(nitrogenlimitationadaptation)编码泛素连接酶，介导AtNPF2.13经泛素化途径降解，氮饥饿条件下NLA的表达受到miR827靶向负调控，促进下游AtNPF2.13表达上调[30]。因此，为了满足幼嫩组织(叶片)生长发育对氮素的需求，当环境中充足时，AtNPF1.1和AtNPF1.2可以将成熟叶片主脉中的(由根转运而来)供给新叶；当环境中缺乏时，AtNPF2.13可促进老叶中贮藏的再分配至新叶。

1.3 参与氮素向繁殖器官的运输和分配

在繁殖生长阶段，植物体由根直接吸收的氮素以及营养器官中储存的氮素大部分将向繁殖器官运输和分配。在NPF基因家族中，AtNPF8.2(AtPTR5)编码寡肽转运蛋白，主要在花粉、胚珠和种子中表达，参与有机态氮素向繁殖器官的运输和分配过程，花粉管萌发试验中该基因增强表达株系的花粉在含毒性二肽(丙氨酰乙硫氨酸)的培养基中萌发严重受阻，而敲除突变体在相同培养基中花粉管生长受影响程度最低[71]。

除有机态氮素(氨基酸、寡肽、多肽等)外，无机态的硝态氮()也可以在繁殖器官积累，并影响种子发育过程。AtNPF2.12(AtNRT1.6)仅发现在繁殖器官(角果、果柄等)维管束表达，并在授粉后表达量显著增加，该基因敲除导致种子中浓度显著降低，形态学分析发现突变体在受精后胚胎发育的1-或2-细胞期，胚柄细胞出现过度分裂与变形萎缩，后期种子败育率显著增加，这一结果说明作为无机态氮源的对于拟南芥早期胚胎发育具有重要作用，AtNPF2.12参与了这一生物学过程[27]。AtNPF5.5在胚中检测有表达，突变导致正在发育的胚中总氮含量显著降低，影响了胚中氮素的积累，其精细表达模式以及影响胚中氮素积累的机制和对种子发育的影响有待进一步研究[43]。

1.4 参与调控植物对氮素()的响应

AtNPF6.3除了作为转运蛋白基因吸收和转运外，还参与调控植物对环境中的响应。首先，AtNPF6.3作为信号因子参与对的初级响应：PNR (primary nitrate response)，即供处理短时间内(0.5～1 h)转运蛋白基因及代谢相关基因迅速增强表达[51]。AtNPF6.3与细胞质膜上受诱导表达上调的离子通道基因CNGC15互作抑制其功能，的供给解离AtNPF6.3与CNGC15的互作，促进后者对Ca2+的吸收，引起细胞质中Ca2+水平显著提高，激活蛋白激酶CPK10/30/32对信号转导途径中关键转录因子NLP7的磷酸化，促进NLP7的质-核穿梭进而激活下游PNR基因[52,102-103]。这一信号转导途径与AtNPF6.3中第101位苏氨酸(Thr)是否磷酸化有关，当环境中浓度较低时，被诱导迅速增强表达的蛋白激酶CIPK23-CBL9复合物对AtNPF6.3中Thr101磷酸化，对具有低水平的初级响应；当环境中浓度较高时，AtNPF6.3 (NRT1.1/CHL1)中Thr101去磷酸化，引发对高水平的初级响应[51]。其次，AtNPF6.3参与对次级响应：SNR(secondary nitrate response)，即PNR中相关基因的表达在长时间处理条件下的反馈抑制[104]。一方面，AtNPF6.3可以诱导转录因子LBD37/38/39表达负向调控PNR基因(如NRT2.1)的表达[53,105]；另一方面，最近报道的PNR负向调控因子NIGTs基因位于关键转录因子NLP7下游，其中NIGT1.3和NIGT1.4对PNR基因的抑制作用依赖AtNPF6.3-CNGC15-Ca2+-CPK-NLP模块，由于NLP对下游诱导基因的直接正向调控相比NLP-NIGTs途径对下游基因的负向调控反应更为迅速，从而导致很多转运蛋白基因(NPF、NRT2)和代谢相关基因(NR、NIA)表现出对的初级响应(PNR)和次级响应(SNR)[104,106-107]。再次，AtNPF6.3参与植物根系适应环境中不同浓度的“觅食”过程。当环境中浓度较低时，AtNPF6.3可以转运生长素，减少侧根原基和新生侧根中生长素的积累，导致侧根生长发育受阻；当环境中浓度较高时，AtNPF6.3的生长素转运功能受到抑制，侧根原基和新生侧根中生长素浓度增加，促进侧根发育[54]。

最近，Chen等[35]报道AtNPF4.4(NRT1.13)在调节体内的分配中具有重要功能。AtNPF4.4定位在细胞质膜，主要在叶柄和茎节部位靠近木质部的薄壁细胞中表达。atnpf4.4表现出浓度依赖的晚花、分支发生与生长缺陷，进一步研究表明，atnpf4.4中经由节向叶片、分支中的“横向”分配减少，并且在低氮(0.2 mmol/L)条件下更为显著。值得注意的是，由于在第10和第11跨膜结构域之间高度保守，对转运活性具有重要作用的脯氨酸位点被丝氨酸取代(P487S)，AtNPF4.4体外试验不具有转运的功能，但可以结合，说明AtNPF4.4可能具有感知体内水平，并通过调节在节部位的横向分配以维持植物对低氮环境的适应性。由于AtNPF4.4不具有转运功能，其参与体内分配的分子机制以及承担转运功能的组分有待进一步发掘。

2 粮食作物中NPF基因在氮素吸收和利用中的生物学功能

2.1 水稻

目前，粮食作物中有关NPF基因的研究主要集中在水稻中(表1、图1)。已报道OsNPF2.4、OsNPF5.16、OsNPF6.1、OsNPF6.3、OsNPF6.5、OsNPF7.1、OsNPF7.2、OsNPF7.4和OsNPF7.7参与吸收过程[76,79-82,85-86,90]，OsNPF4.5在根系通过丛枝菌根共生途径获取中具有重要功能[78]，进一步拓宽了人们对植物获取途径的认知，这些基因在参与吸收过程中是否存在互作关系(协同、冗余、拮抗等)有待深入研究。其中OsNPF2.4和OsNPF6.5与另外一个家族成员OsNPF2.2在根维管组织(木质部)中表达量较高，与拟南芥中AtNPF2.3、AtNPF6.3和AtNPF7.3功能相似，三者亦参与由根向地上部的长距离运输过程[75-76,82]；OsNPF5.16在根、茎基部和叶鞘中表达水平较高，亦参与由根向叶鞘的分配过程[79]；OsNPF7.2主要在根伸长区和成熟区厚壁细胞、皮层与中柱表达，除了参与吸收，还与在根中不同部位的分配有关[86]；OsNPF7.7存在两种可变剪接OsNPF7.7-1(编码较长产物)和OsNPF7.7-2(编码较短产物)，分别定位在细胞膜(OsNPF7.7-1)和液泡膜(OsNPF7.7-2)，提高其表达水平则分别促进了对和的吸收[90]。值得注意的是，OsNPF5.16与已报道NFP7亚家族成员OsNPF7.1、OsNPF7.2、OsNPF7.3、OsNPF7.4和OsNPF7.7均参与水稻蘖芽的发育，并最终影响水稻分蘖。其中OsNPF7.1和OsNPF7.4在蘖芽中对不同供氮水平具有相反的表达模式，对蘖芽的生长发育分别具有促进和抑制作用[85]。分析表明，OsNPF5.16和OsNPF7.2表达变化影响了茎蘖基部细胞分裂素(cytokinins, CKs)水平，并且后者同时影响了独脚金内酯(strigolactones, SLs)信号途径相关基因的表达，说明CKs信号途径参与了OsNPF5.16依赖的蘖芽生长发育[79]，CKs和SLs信号途径协同参与了OsNPF7.2依赖的蘖芽生长发育[87]，对于其它NPF基因(OsNPF7.1、OsNPF7.3、OsNPF7.4和OsNPF7.7)参与蘖芽生长发育是否涉及CKs、SLs或其它激素(如生长素)，有待进一步研究。

OsNPF6.5(OsNRT1.1B)是AtNPF6.3(NRT1.1/CHL1)在水稻中的功能性同源基因，该基因定位在细胞膜上，受诱导表达显著增强[82]。与AtNPF6.3类似，OsNPF6.5不仅参与吸收和由根向地上部的长距离运输，还参与调控水稻对初级响应[81-82]。不同于拟南芥PNR反应中依赖AtNPF6.3、由第二信使Ca2+和磷酸化修饰介导信号关键转录因子AtNLP7的质-核穿梭[104]，在OsNPF6.5调控的PNR反应中，磷信号途径关键抑制因子OsSPX4可以与信号关键转录因子OsNLP3互作抑制其质-核穿梭，可以促进OsNPF6.5与OsSPX4结合，并招募OsNPF6.5互作蛋白OsNBIP1 (OsNRT1.1B Interacting Protein 1)介导OsSPX4经泛素化途径降解，增强OsNLP3的质-核穿梭引发PNR反应，同时促进了磷信号途径相关基因的表达[83]。因此，水稻中OsNPF6.5作为关键因子整合了信号转导途径(PNR反应)和受调节的磷信号转导途径(即促进对磷的吸收利用)。进一步研究表明，OsNPF6.5还可以调节水稻根际氮代谢功能相关微生物区系组成，影响根际对氮素的吸收[84]。Wang等[81]报道了AtNPF6.3在水稻中的另外一个同源基因OsNPF6.3(OsNRT1.1A)。不同于OsNPF6.5定位在细胞膜，OsNPF6.3定位在液泡膜，并且受另外一种无机态氮素铵诱导表达显著增强。与OsNPF6.5基因功能相比，OsNPF6.3不仅能促进对的吸收，还促进了对的吸收，说明OsNPF6.3在对不同形态氮素的吸收和利用中可能起着更为基础的作用[81]。

2.2 玉米

目前，粮食作物玉米中已报道4个NPF基因的生物学功能(表1、图1)。ZmNPF7.9在胚乳转移细胞特异性表达，该基因突变导致籽粒中浓度显著降低，并引发严重的籽粒发育障碍(胚乳发育迟缓、淀粉沉积异常、粒重显著降低等)，说明无机态的对于玉米籽粒(胚乳)发育具有重要作用，ZmNPF7.9参与了这一生物学过程[96]。ZmNPF8.8(ZmPTR1)主要在种子萌发过程中盾片上皮细胞中表达，拟南芥中异源表达ZmNPF8.8在二肽(Ala-Ala)作为唯一氮源的培养基中，种子吸胀后萌发的存活率显著高于对照材料，说明ZmNPF8.8可能参与萌发籽粒中有机态氮素(二肽等)向胚的运输过程[97]。

借助定点诱变和电生理技术，Wen等[95]对玉米中AtNPF6.3两个同源基因ZmNPF6.4 (ZmNRT1.1A)和ZmNPF6.6 (ZmNRT1.1B)的吸收特性进行了深入研究，发现二者在功能上出现分化，分别对Cl-和具有高亲和力(high-affinity)吸收特性。ZmNPF6.6中含有与结合的关键组氨酸位点(His-362, 拟南芥AtNPF6.3中该位点为His-356[99-100])，而在ZmNPF6.4中该位点被酪氨酸(Tyr-370)取代。将ZmNPF6.6中该关键组氨酸位点突变成酪氨酸(His-362-Tyr)，导致ZmNPF6.6丧失了对的转运功能；在ZmNPF6.4中引入该关键组氨酸位点(Tyr-370-His)，则使ZmNPF6.4获得了对的高亲和力吸收特性[95]。通过改变NPF基因编码蛋白中特定氨基酸位点，为提高作物氮素吸收利用(包括对Cl-的耐受性)提供了新的视角。

2.3 小麦

粮食作物小麦是异源六倍体(基因组类型为AABBDD)，基因组庞大并且十分复杂[108]。目前，小麦中有关NPF基因在氮素吸收利用中生物学功能的研究尚未见报道，但已有证据表明NPF基因参与小麦对氮素的吸收利用过程[109-111]。最近，Wang等[15]和Li等[16]分别对小麦中NPF基因家族进行了系统鉴定与分析，发现小麦基因组中含有高达331个NPF基因，其数量远高于水稻(93个)和玉米(79个)。小麦中家族成员众多的NPF基因在氮素吸收利用中的生物学功能有待发掘与解析。

3 结论与展望

如前所述，目前粮食作物玉米(含79个NPF基因)中仅有4个NPF基因的生物学功能被报道，在小麦(含331个NPF基因)中尚未有相关报道，未来对玉米和小麦中NPF基因的发掘与功能研究，将为改良作物氮素利用效率提供新的基因资源。此外，现有文献报道中对NPF基因功能的研究多采用水培与盆栽试验，试验条件为单一氮水平(高氮或低氮)处理。在自然环境中，作物生长在多重氮水平条件下，并且在不同生长发育阶段对氮素的需求各异，因此，实践中需要考虑综合运用多种策略(调节氮素吸收、转运、分配/再分配、代谢及其调控基因的综合表达)探索提高作物的氮素利用效率。