氮肥对大豆结瘤固氮、籽粒产量和蛋白质含量的影响

邹 狮，严 君，韩晓增，邹文秀，陈 旭，陆欣春

（1 中国科学院东北地理与农业生态研究所，黑龙江哈尔滨 150081；2 中国科学院大学，北京 100049）

大豆生长发育所需要的氮素主要来源于土壤氮、肥料氮和根瘤固氮，仅依靠根瘤固氮只能为大豆提供50%～60%的氮素，还无法满足大豆高产的需求，因此在生产上还需要施用氮肥[1-2]。然而不合理的施用氮肥会抑制大豆结瘤和固氮，对大豆产量和蛋白质含量亦会产生不利影响，因此在生产上需要协调好氮肥—结瘤固氮—产量和蛋白质含量之间的关系[1,3]。

与禾本科作物相比，大豆是需氮较高的作物，但不同生长发育阶段的需氮量有差异[4-8]。有研究表明，在大豆V4期施氮根瘤数量减少52%，地下生物量降低19%[9]。Gan等[7]研究表明，V2期和R1期是最佳的氮肥施用时期，其中V2期施氮不同基因型大豆在R1阶段根瘤干重较不施N处理提高了16%～23%，而R1期施氮更有利于增加植株对氮素的吸收和产量的增加，武引9、油91-19和巨丰3种基因型R1期施氮大豆产量提高了21%～27%；等量氮肥在R3期施用抑制大豆结瘤，对大豆产量亦无显著的促进作用[7-8]。V6期和R2期施氮大豆籽粒蛋白质含量显著下降[10]。因此氮肥施用时期和施用量对大豆根瘤固氮能力、产量和籽粒蛋白质含量有直接的影响。生产1 t/hm2大豆籽粒需要80 kg/hm2的氮，其中50%～80%来自于共生固氮[1]。此外Tamagno等[11]研究表明，大豆籽粒产量与大豆植株酰脲相对丰度(固氮能力评价的指标)和蛋白质含量呈负相关关系，酰脲相对丰度与蛋白质含量呈正相关关系。因此大豆固氮能力的高低与产量和籽粒蛋白质含量存在一定的内在关系。

东北黑土区是我国重要的大豆产区，该地区在生产上大豆的氮肥(尿素)施用量通常＞120 kg/hm2[12]。前人的研究大多注重不同施氮时期不同施氮量对大豆固氮、生长、产量及蛋白质含量的影响，但缺少结瘤固氮与籽粒产量和蛋白质含量之间关系的研究[13-14]。因此本研究选择在大豆氮肥最佳施用的V2期和R1期施用不同量的氮肥，研究与大量氮肥施用相比，减少氮肥施用对大豆结瘤固氮、产量和籽粒蛋白质含量的影响以及它们之间的内在相互关系，为大豆高产优质高效栽培提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 供试材料及方法

盆栽试验于2021年5—10月在中国科学院东北地理所温室进行。供试土壤为黑土，土壤有机碳含量为38.6 g/kg、全氮含量为2.96 g/kg、碱解氮含量为192.2 mg/kg、全磷含量为0.7 g/kg、速效磷含量为34.2 mg/kg、全钾含量为23.7 g/kg、速效钾含量为130.7 mg/kg。供试大豆品种为‘东生35’。

试验设施氮(N)量设3个水平： N 0、5、100 mg/(kg, 土)，分别表示为N0、N5、N100；2个施用时期：大豆生长发育的V2期(第二片三出复叶全展期)和R1期(始花期)，氮肥溶于水中施入，共5个处理，每个处理4次重复。供试氮肥为尿素(N 46%)，除此之外，在土壤装盆前，将过磷酸钙(15% P2O5)、硫酸钾(K2O 52%)均按3 mg/(kg, 土)的量与土壤混合。供试容器为PVC盆，直径20 cm、高45 cm，每盆装土5.5 kg。每盆扎4个浅穴，每穴内播2粒种子，覆土3～4 cm，齐苗后每盆保留2株。

1.2 样品采集与分析

在大豆生长发育的盛花期(R2期)和鼓粒始期(R5期)采集植株样品。将完整的大豆根系从盆栽土壤中取出洗净后，分别测定大豆地上干重、根瘤数量、根瘤干重及固氮酶活性。根瘤固氮酶活性的测定采用乙炔还原法[15-16]。成熟期(R8期)取样，测定大豆籽粒产量和蛋白质含量，大豆籽粒蛋白质含量采用凯氏定氮法[17]进行测定，测定全氮后换算为籽粒蛋白质含量。

1.3 数据分析

采用SPSS 2020软件对不同氮肥施用时期和施用量处理下大豆地上干重、根瘤数量及干重、固氮酶活性、籽粒产量和蛋白质含量进行双因素有交互作用的ANOVA方差分析，并采用Duncan多重比较进行0.05水平上的显著性差异检验。使用Amos Graphics软件对大豆根瘤数量、干重、固氮酶活性和大豆籽粒产量及蛋白质含量建立结构方程模型图(Structural Equation Model，SEM)。

2 结果与分析

2.1 不同氮肥施用时期和施用量对大豆地上部干物质积累的影响

不同氮肥施用时期和施用量对R2期和R5期的大豆地上部干重的影响有差异(图1)，N0处理的地上干重均最低，而N100处理R2期的地上干重最高，R5期N5处理地上干重最高。V2期施氮，N100处理在R2期和R5期的地上干重分别较N0处理增加了66.6%和10.6%；R1期施等量氮，则分别增加了37.2%和24.3%。在R2期时大豆地上干重表现为V2期施氮＞R1期施氮，在R5期时则呈R1期施氮＞V2期施氮。整体上氮肥施用量和氮肥施用时期对大豆地上干重均有显著影响(P＜0.05)。

图1 氮肥施用时期和施用量对大豆地上部干物质积累量的影响Fig.1 Effects of N fertilizer application time and rate on aboveground dry weight of soybean

2.2 不同氮肥施用时期和施用量对大豆根瘤特性的影响

V2期和R1期施用氮肥，大豆根瘤数量均随着施氮量的增加呈下降的变化趋势(图2)。V2期施氮，N5和N100处理较N0处理R2期大豆根瘤数量分别下降了18.0%和59.9%,在R5期分别下降了16.5%和28.2%。R1期施氮，N5和N100处理较N0处理在R2期大豆根瘤数量分别下降了21.0%和42.3%；在R5期分别下降了7.1%和27.8%。V2期和R1期两个施氮时期，大豆根瘤数量R5期N5处理表现为R1期施氮＞V2期施氮，两者无显著差异；R2期N100处理表现为R1期施氮＞V2期施氮(P＜0.05)。方差分析结果表明，施氮量对R2期和R5期根瘤数量均有显著影响，而施氮时期对根瘤数量均无显著影响，施氮时期和施氮量交互作用对R2期根瘤数量有显著影响。

图2 不同氮肥施用时期和施用量下大豆的根瘤数量Fig.2 The nodule number of soybean as affected by N fertilizer application time and rate

随着生育时期的推进，大豆根瘤干重与根瘤数量的变化趋势基本一致，均以N100处理的大豆根瘤干重最低(图3)。V2期施氮，R2期和R5期大豆根瘤干重N100处理较N0处理分别下降了81.9%和49.0%；而在R1期施用等量氮肥时，分别下降了32.8%和47.8%。V2期和R1期施氮，N5处理在R2期的大豆根瘤干重无显著差异，在R5期大豆根瘤干重表现为R1期施氮＞V2期施氮；而N100处理下大豆根瘤干重在R2期表现为R1期施氮＞V2期施氮(P＜ 0.05)，在R5期的大豆根瘤干重无显著差异。方差分析结果表明：施氮量、施氮时期及两者的交互作用均对R2期大豆根瘤干重有显著的影响，而施氮量对R5期大豆根瘤干重有显著影响。

图3 不同氮肥施用时期和施用量下大豆根瘤干重Fig.3 The nodule dry weight of soybean as affected by N fertilizer application time and rate

2.3 不同氮肥施用时期和施用量对大豆根瘤固氮酶活性的影响

V2期和R1期施用氮肥，大豆总固氮酶活性均随施氮量的增加呈先增加后下降的变化趋势，即N5处理的根瘤固氮酶活性最大，V2和R1两个施肥期分别达到 14.15 和 23.4 μmol/(g·h) (图4)。V2 期施氮，R2期和R5期的大豆固氮酶活性N5处理较N0处理分别增加了15.3%和27.1%，而N100处理较N5处理分别下降了17.7%和40.1%，较N0处理分别下降了5.1%和23.9%。N100处理下两个施氮时期在R2期固氮酶活性表现为V2期施氮＞R1期施氮，在R5期则表现为V2期施氮＜R1期施氮；N5处理下，两个施氮时期在R2期和R5期根瘤固氮酶活性均表现为V2期施氮＜R1期施氮。方差分析结果表明：施氮量、施氮时期及两者的交互作用均对R2期大豆根瘤固氮酶活性有显著的影响，而施氮量对R5期大豆根瘤固氮酶活性有显著影响。

图4 氮肥施用时期和施用量对大豆根瘤固氮酶活性的影响Fig.4 Effects of N fertilizer application time and rate on soybean nodule nitrogenase activity

2.4 不同氮肥施用时期和施用量对大豆籽粒产量和蛋白质含量的影响

氮肥施用量对大豆籽粒产量和蛋白质含量均有显著影响(表1)。V2期和R1期施氮，大豆籽粒产量均以N5处理最高，分别达21.70和21.48 g/pot，而N100处理大豆籽粒产量显著低于N5，甚至与N0无显著差异。V2期施氮，N5处理大豆籽粒蛋白质含量较N0处理增加了6.3%，N100的蛋白质含量与N0无显著差异；R1期施氮，N5处理大豆籽粒蛋白质含量较N0处理增加了9.4%，而N100的蛋白含量与N0无显著差异。大豆籽粒产量的变化表现为V2期施氮＞R1期施氮，大豆籽粒蛋白质含量表现为R1期施氮＞V2期施氮，但整体上施氮时期对大豆籽粒产量和蛋白质含量无显著影响。

表1 氮肥施用时期和施用量对大豆籽粒产量和蛋白质含量的影响Table 1 Effects of N application time and rate on yield and protein content of soybean seed

2.5 大豆根瘤数量、干重、固氮酶活性、籽粒产量和蛋白质含量之间的关系

通过对大豆根瘤数量、干重、固氮酶活性、籽粒产量和蛋白质含量之间的相关性分析，结果(表2)表明大豆根瘤数量和干重极显著正相关，固氮酶活性与大豆籽粒产量和蛋白质含量显著正相关。大豆籽粒的产量与蛋白质含量极显著正相关关系。

表2 大豆根瘤数量、根瘤干重、固氮酶活性、籽粒产量和蛋白质含量之间的相关关系（r）Table 2 Correlation among nodule number, root dry weight, nitrogenase activity, seed yield and protein content

进一步通过结构方程图(SEM)模型来评估不同施氮量和施氮时期条件下大豆结瘤数量、干重和固氮酶活性与大豆籽粒产量和蛋白质含量之间的关系(图5)。SEM模型拟合度较高，能够有效解释大豆籽粒产量和蛋白质含量的变异，结构方程模型解释大豆籽粒产量总变异的77.5%，解释籽粒蛋白质含量总变异的77.9%。施氮量对籽粒蛋白质含量负向调控(P＜0.001)，对产量正向调控(P＜0.05)，还通过影响根瘤数量和固氮酶活性对大豆产量和蛋白质含量进行调控，其通径系数分别为-0.78和0.90。施氮时期对籽粒产量负向调控，正向调控籽粒蛋白质含量，但对根瘤干重和固氮酶活性无直接的调控关系。根瘤数量对大豆籽粒蛋白质含量进行负向调控，固氮酶活性对大豆籽粒蛋白质含量进行正向调控，其通径系数分别为-0.60和0.45。根瘤干重和固氮酶活性对大豆籽粒产量进行正向调控，其通径系数分别为0.53和 0.66。

图5 施氮量和施氮时期下根瘤特性、固氮酶活性、籽粒产量和蛋白质含量之间的结构方程图Fig.5 Structure equation map (SEM) of nodule characteristics, nitrogenase activity, yield and protein content with various N application time and rate

3 讨论

适时适量的施用氮肥能够改善土壤养分的供应，促进大豆干物质量积累、根瘤固氮能力和大豆产量的提高，因此氮肥施用时期和施用量是决定大豆籽粒产量和蛋白质含量的关键因素[18-19]。在本研究中，在大豆V2期和R1期施用不同量氮肥，大豆的干物质积累量和产量与N0处理相比显著提升，整体上大豆干物质积累量变化表现为V2期施氮＜R1期施氮。同样Gan等[7,20]在盆栽和田间试验中的结果表明，在大豆V2期和R1期施氮能够显著促进大豆生物量、氮积累总量和产量的提升。在R1期施用氮肥能更有效的促进大豆干物质的积累，主要通过增加作物叶片叶绿素含量和光合能力，进而为大豆高产提供充足的物质保障[21-22]。此外本研究中无论是V2期还是R1期施用氮肥，N100处理R2期大豆的干物质积累量最高，而大豆产量则在N5处理时最高，N5和N100处理对大豆干物质量积累和产量的影响不一致，与大豆生长发育各生育时期对氮素的需求不同有关，在根瘤固氮系统形成前，大豆氮素主要用于生长发育(干物质积累)，施氮量越高大豆干物质积累量越高；在根瘤固氮系统形成后的生殖生长阶段，如R1期大豆需要的氮素用于大豆籽粒(产量和蛋白质)的建成，而大豆籽粒的建成还与根瘤固氮有一定的关系。此外Liu等[12]在黑土上的研究表明，N5和N100处理大豆籽粒产量无显著差异，与本研究结果略有不同，产生差异的原因可能是氮肥施用的时期、选用的大豆品种和土壤基础肥力不同。

氮肥施用时期和氮肥施用量对大豆根瘤数量和干重有影响[9]。在本研究中V2期和R1期施高氮的N100处理，大豆R2期和R5期根瘤数量较N0处理分别下降了42.3%～59.9%和27.8%～28.2%，根瘤干重较N0处理分别下降了32.8%～81.9%和47.8%～49.0%。N5处理下大豆根瘤数量和干重较N0处理有所下降，但显著高于N100处理。这主要是由于施用氮肥后土壤有效氮浓度增加，一方面抑制了土壤中大豆根瘤菌的繁殖，进而其对大豆根系的侵染和定殖减少[23]。另一方面大豆进行自我调控，直接吸收消耗能量较少的土壤无机氮供大豆生长发育，减少或降低了消耗能量的根瘤固氮过程，从而导致了大豆结瘤数量和干重降低[24-26]。Akinori等[26]的研究同样表明，当土壤有效氮浓度低时，大豆更倾向于促进大豆根瘤的生长以及固氮功能的发挥；而土壤有效氮浓度高时，抑制大豆结瘤，则促进侧根生长，以便更好的增加氮素吸收。然而在侧根形成过程中，根部较高的光合同化物消耗量减少了对根瘤光合同化物的供应，相应的抑制了大豆根瘤的生长和固氮能力[25]。本研究供试的土壤是肥沃的黑土，即本底土壤有效氮浓度和有机质含量较高，施用氮肥(N5和N100)大豆根瘤数量和干重较N0处理均下降，V2期施氮对大豆根瘤数量和干重的抑制作用整体表现为大于R1期施氮处理，即大豆根瘤数量和干重V2期施氮＜R1期施氮。同样Mccoy等[9]研究表明V4期施氮，根瘤数量减少了52%，且施用低氮(45 kg/hm2)和高氮(135 kg/hm2)处理下的根瘤数量无显著差异。Marschner等[8]研究表明，在生长发育前期，适量施氮有利于大豆生长，同时有利于根瘤侵染和定殖。此外Gan等[7]研究表明，V2期施用氮肥促进大豆结瘤固氮，R1期施用等量氮肥抑制大豆结瘤固氮。因此掌握大豆关键生育时期对氮素需求量，对于研究大豆结瘤固氮和生长发育有重要作用。

固氮酶活性是衡量根瘤固氮的重要指标，其活性的高低与氮有密切的关系[16,21]。Daimon等[27]研究表明，施用3.5 mmol/L的硝态氮，豆科植物(花生)根瘤数量、干重和固氮酶活性最高。王树起等[28]研究表明，不论何种施氮方式均降低了根瘤固氮酶活性，且随着施氮量的增加抑制作用增强。而本研究中，V2和R1期施氮均以N5处理下的根瘤固氮酶活性(1 g根瘤干重)最高。与本研究结果相似，Lyu等[16]在大豆分根试验上的研究结果表明，施高氮处理大豆根瘤固氮酶活性低于施用低氮处理。还有研究表明在较长时间给大豆一侧根系局部施氮，根瘤固氮酶活性施氮侧与未施氮侧均随氮量的增加呈先升高后降低的单峰变化趋势[29]。这种不一致的情况可能是，在这些研究中，土壤氮和有机质含量较低[30-32]。适量施用氮肥促使根瘤固氮酶活性高峰期向后推移，大豆根系和根瘤的衰老减缓，从而有利于大豆生育后期干物质和养分的积累[33]。在本研究中R1期施氮大豆根瘤固氮酶活性高于V2期施氮，这与根瘤数量和干重的变化趋势一致(图2、图3和图4)，这也验证了本研究结构方程模型中，根瘤数量通过影响根瘤干重对固氮酶活性正向调控，而固氮酶活性对大豆产量和蛋白质含量也具有正向调控作用(图5)。以往的研究中固氮酶活性与氮肥都是负相关的[34-35]，而在本研究中却是正相关，这主要与所选用的固氮酶活性的评价指标是单个根瘤的固氮酶活性，而不是总的固氮酶活性等因素有关。在以后的研究中还需要进一步增加氮肥施用量以及选用更多的固氮评价指标，才能更好地明确根瘤固氮与氮肥之间的关系。

在大豆生长发育期施氮会提高大豆籽粒产量和蛋白质含量，缺氮会导致大豆籽粒产量及蛋白质含量显著下降[36]。在开花前施氮肥大豆籽粒蛋白质含量平均增加0.7%，而在开花和结荚期间施用氮肥籽粒蛋白质含量平均增加1.1%[37]。Wilson等[38]研究表明，MG2大豆品种种植期间施用560 kg/hm2的氮肥，籽粒蛋白质含量增加，但对产量没有显著影响。本研究中N5处理时大豆籽粒产量和蛋白质含量最高。V2期施氮对大豆籽粒蛋白质含量的影响低于R1期施肥，这可能是由于生殖生长阶段大豆根瘤开始衰老，根瘤氮和土壤氮的供应不能满足豆科植物的生长需求，补充氮肥不仅可以缓解根瘤衰老，还能增加作物叶片叶绿素含量和光合能力，提高叶片蔗糖和淀粉含量和促进干物质向籽粒的转运[36,39]。在本研究中结构方程模型结果表明，施氮量主要是通过影响大豆根瘤数量和固氮酶活性间接影响大豆籽粒产量和蛋白质含量，其中根瘤数量对大豆籽粒蛋白含量有负向调控作用，而固氮酶活性对大豆籽粒产量和蛋白质含量起正向调控作用。因此要想提高大豆籽粒产量和蛋白质含量需要在适当的生育时期施用适量的氮肥，要在大豆关键生育时期氮吸收过程(即生物固氮和矿质氮吸收)的研究方面下功夫[40]。

4 结论

施氮量对大豆籽粒产量和蛋白质含量的影响大于施氮时期，施氮量正向调控大豆产量，负向调控大豆籽粒蛋白质含量。施氮量通过影响大豆根瘤数量和固氮酶活性，间接影响大豆籽粒产量和蛋白质含量，其中根瘤数量对大豆籽粒蛋白含量有负向调控作用，而固氮酶活性对大豆籽粒产量和蛋白质含量起正向调控作用。施氮肥有利于地上干物质积累量的增加，但抑制大豆的结瘤和根瘤的发育。第二片三出复叶全展期(V2期)施用氮肥对大豆产量提升作用显著，而始花期(R1期)施氮则对大豆固氮和籽粒蛋白质含量的增加作用显著，但施氮量需要控制在N 5 mg/(kg, 土)为宜。