SMAD7 在多发性骨髓瘤中的表达及对细胞增殖和耐药的影响

丁 贺，曹杨琳，何 杨，魏 星，杨剑峰

1.苏州大学苏州医学院唐仲英医学研究院血液学研究中心，苏州 215123；2.苏州大学附属第一医院江苏省血液研究所，苏州 215006；3.苏州大学附属第一医院消化内科，苏州 215006

临床上，多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）常表现为恶性浆细胞在骨髓中的克隆性增生，是仅次于非霍奇金淋巴瘤的第二常见的血液系统恶性肿瘤［1］。大多数MM患者的异常浆细胞可表达单克隆免疫球蛋白（也称M 蛋白）。研究［2］显示，MM 可损害相关终末器官，导致高钙血症、肾功能不全、贫血和骨质破坏等。近20年来，自体造血干细胞移植、新型治疗药物的开发以及CAR-T细胞治疗、双特异抗体等新兴免疫疗法的应用已显著改善了MM患者的治疗效果，但由于其耐药、复发等因素使得绝大多数患者仍不能完全被治愈［3-6］。因此，继续深入探索MM的发病机制及其新的治疗策略是临床亟待解决的一大问题。

Sma 和Mad 相 关 蛋 白7 （Sma- and Mad-related protein 7，SMAD7）是转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信号通路的重要抑制性分子，在多种实体瘤（如胃癌、乳腺癌、鳞状细胞癌等）中参与肿瘤的生长、转移、耐药等［7-9］。目前，SMAD7 在MM 中的表达及在骨髓瘤发生发展中的生物学功能尚未被研究报道。基于此，本研究结合生物信息学分析，检测健康捐献者和MM 患者的骨髓CD138+细胞中SMAD7mRNA的相对表达，并通过体外功能实验验证SMAD7 对MM 细胞增殖、耐药的影响，从而为MM的靶向治疗提供一定的理论基础。

1 资料与方法

1.1 数据收集及分析

从基因表达综合（gene expression omnibus，GEO）数据库中下载MM数据集GSE5900、GSE6477、GSE13591。GSE5900 数据集包含22 例健康捐献者、44 例意义未明单克隆丙种球蛋白血症（monoclonal gammopathy of undetermined significance，MGUS） 和12 例冒烟型骨髓瘤（smoldering myeloma，SMM）的数据，分析SMAD7在健康捐献者和进展为MM的2个前期阶段（即MGUS、SMM） 中的表达差异。GSE6477数据集包含15例健康捐献者、22例MGUS、24例SMM和73例新诊断MM的数据，分析SMAD7在该病例中的差异表达。GSE13591数据集包含5例健康捐献者、11例MGUS、133例MM和9例浆细胞白血病（plasma cell leukemia，PCL）的数据，分析SMAD7在该病例中的差异表达。GEO数据库提取的SMAD7表达数据均采用R4.0.1软件进行分析。

1.2 标本收集、临床资料获取及分析

选择2021年6月—2022年3月于苏州大学附属第一医院血液科的8例健康捐献者和20例MM患者。收集健康捐献者及MM患者的骨髓穿刺标本。同时，从医院电子病历系统获取MM患者的临床资料，包括年龄、性别、浆细胞比例、血红蛋白（hemoglobin，Hb）、肌酐（creatinine，Cr）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）、骨质破坏情况，分析SMAD7mRNA相对表达与患者临床资料的关系。

1.3 细胞和主要试剂

人骨髓瘤细胞KMS11和人胚肾细胞293T均由苏州大学苏州医学院唐仲英医学研究院血液学研究中心保存。

人淋巴细胞分离液购自北京索莱宝科技有限公司，人CD138+磁性微珠购自德国Miltenyi公司，RPMI 1640培养基、DMEM 培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国Gibco 公司，含绿色荧光蛋白（green fluorescent protein， GFP） 标 签 的pReceiver-Lv215慢病毒空载体质粒（Vector）和pReceiver-Lv215-SMAD7慢病毒重组质粒（Lv-SMAD7）均购自广州复能基因有限公司，反转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒和细胞凋亡试剂盒均购自南京诺唯赞生物科技有限公司，SMAD7 抗体购自美国GeneTex 公司，GAPDH抗体均购自美国ProteinTech公司，CCK8试剂盒、细胞周期检测试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司，硼替佐米购自美国Selleck公司。

1.4 方法

1.4.1 标本处理 向骨髓穿刺标本中加入等体积0.9%NaCl溶液，以重悬、混匀。将该混合液沿管壁缓慢加入含淋巴细胞分离液的离心管中，室温下500×g离心30 min。随后，吸取含淋巴细胞的白膜层细胞置于洁净离心管中，并向其中加入等体积的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS），于300×g离心10 min。弃上清液后用1 mL PBS重悬细胞并计数，向每2×107个细胞中加80 μL 缓冲液及20 μL CD138 磁珠，混匀后于4 ℃避光孵育15 min，最后于MACS磁珠分选器的MS 分选柱中进行分选，以获得CD138+细胞。

1.4.2 标本骨髓CD138+细胞中SMAD7mRNA 相对表达检测 采用实时荧光定量PCR（quantitative realtime PCR，qPCR）检测SMAD7mRNA 的相对表达。TRIzol 法提取经磁珠分选的CD138+细胞总RNA，经反转录试剂盒合成cDNA 后，利用SYBR®qPCR Master Mix 反应体系和StepOne real-time PCR 仪进行qPCR 检测。具体反应条件参照说明书进行。采用2-ΔΔCT法 分 析SMAD7mRNA 的 相 对 表 达 量，以GAPDH为相对内参。引物序列见表1。

表1 qPCR引物序列Tab 1 Primer sequences for qPCR

1.4.3 细胞培养 于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中，采用含10% FBS、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 链霉素的RPMI 1640 培养基培养KMS11 细胞，采用含10% FBS、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 链霉素的DMEM 培养基培养293T 细胞。每隔2～3 d 传代1 次，取对数生长期的细胞行后续实验。

1.4.4 慢病毒包装 将293T 细胞以4×106个/皿接种于细胞培养皿中，使用慢病毒包装试剂盒将质粒Vector、Lv-SMAD7分别与包装质粒和293T 细胞共转染14～16 h，而后更换新鲜培养基继续培养24 h，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液。

1.4.5 慢病毒转染及稳定过表达SMAD7的细胞株建立 将KMS11细胞以2×105个/孔接种于6孔板，向其中分别加入上述慢病毒上清液进行感染，并添加终浓度为5 μg/mL 聚凝胺提高感染效率。感染24 h后，更换新鲜培养基继续培养48 h，于荧光显微镜下观察慢病毒感染效率。同时，待细胞数量达2×106个时，采用流式细胞分选仪分选GFP+细胞，以获得稳定转染的KMS11 细胞。而后，采用蛋白质印迹法（Western blotting）验证转染KMS11 细胞中SMAD7 的表达效果，以建立稳定过表达SMAD7的KMS11细胞株。

1.4.6 细胞增殖能力检测 将转染Vector 或Lv-SMAD7的KMS11 细胞分别按照3×103个/孔接种至96孔板，于37 ℃、5% CO2条件下培养0、1、2、4 d。而后，向每孔加入10 μL CCK8试剂继续培养4 h，于酶标仪检测细胞的D（450 nm）并进行统计分析。

1.4.7 细胞周期分布检测 分别收集转染Vector 和Lv-SMAD7的KMS11 细胞，用预冷的PBS 进行洗涤，弃尽上清液。用1 mL 预冷的PBS 重悬细胞，并向其中轻轻地边涡旋边逐滴滴加3 mL 预冷的无水乙醇溶液直至其终浓度为75%，遂于-20 ℃下对细胞固定过夜。次日，用PBS 洗涤细胞后，向其中加入400 μL PI 染色液，于37 ℃染色30 min，采用流式细胞仪检测细胞的周期分布。

1.4.8 硼替佐米药物处理后的细胞活力检测 将转染Vector或Lv-SMAD7的KMS11 细胞分别按照8×103个/孔接种于96孔板，向其中添加硼替佐米药物至终浓度分别为0、20、40、60、80 nmol/L，于37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养24 h。而后，向每孔添加15 μL CCK8 试剂继续培养4 h，于酶标仪检测D（450 nm）并进行统计分析。

1.4.9 硼替佐米药物处理后的细胞凋亡检测 将转染Vector或Lv-SMAD7的KMS11细胞分别按3×105个/孔接种到6 孔板，并添加终浓度为40 nmol/L 的硼替佐米药物，于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养24 h，收集细胞并使用细胞凋亡试剂盒进行染色，于流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。

1.5 统计学方法

使用GraphPad Prism 8.3.0软件进行数据处理和绘图。对于符合正态分布的定量资料以±s表示，使用t检验进行2 组间比较。对于不符合正态分布的定量资料以M（Q1，Q3）表示，使用Mann-WhitneyU检验进行2组间比较。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 GEO数据库中与MM相关的SMAD7表达分析

对GEO 数据库中检索获取的3 个数据集中的SMAD7表达数据进行分析，结果显示：GSE5900数据集中，MM患者的2个前期阶段MGUS、SMM相较于健康捐献者，其SMAD7表达均较高（均P=0.000，图1A）；GSE6477数据集中，新诊断MM患者的SMAD7表达较健康捐献者有所上调（P=0.001，图1B）；GSE13591 数据集中，MM、PCL 患者较健康捐献者，其SMAD7表达均有上调（均P＜0.05，图1C）。

图1 GSE5900（A）、GSE6477（B）、GSE13591（C）数据集中与MM相关的SMAD7的表达分析Fig 1 Expression analysis of SMAD7 associated with MM in the GSE5900(A),GSE6477(B)and GSE13591(C)datasets

2.2 SMAD7 mRNA 在健康捐献者及MM 患者中的相对表达

为进一步分析SMAD7在MM 患者中的表达情况，本研究采用qPCR 分析8 例健康捐献者及20 例MM 患者骨髓CD138+细胞中SMAD7mRNA 相对表达水平。结果（图2）显示，MM 患者SMAD7mRNA 相对表达水平较健康捐献者有所升高（P=0.002）。

图2 SMAD7 mRNA 在健康捐献者及MM 患者的骨髓CD138+细胞中的相对表达Fig 2 Relative expression of SMAD7 mRNA in bone marrow CD138+cells from healthy donors and MM patients

2.3 SMAD7 mRNA 相对表达水平与MM 患者临床资料的关系

对20 例MM 患者的临床资料与SMAD7mRNA 相对表达进行统计分析，结果（表1）发现，在患者的性别、年龄、浆细胞比例、Hb 水平、Cr 水平、LDH水平、骨质破坏情况等指标中，SMAD7mRNA 相对表达水平间差异均无统计学意义。

表1 SMAD7 mRNA相对表达水平与MM患者临床资料的关系Tab 1 Relationship between the relative expression of SMAD7 mRNA and clinical information of patients with MM

2.4 SMAD7对KMS11细胞增殖的影响

为评估SMAD7 在MM 发生与发展中的生物学功能， 本研究分别向KMS11 细胞转染Vector、Lv-SMAD7，并采用Western blotting 进行检测；结果（图3A）发现，与转染Vector 后的细胞相比，在转染Lv-SMAD7后的KMS11 细胞中SMAD7 的表达显著升高，即成功构建了稳定过表达SMAD7 的KMS11 细胞株。

接着， 采用CCK8 法检测分别经Vector、Lv-SMAD7转染的KMS11 细胞的增殖能力，结果（图3B）显示，与Vector 组细胞相比， Lv-SMAD7组细胞在接种后1、2、4 d 的活力均较高（均P＜0.05）。而后，利用流式细胞术检测Vector 组和Lv-SMAD7组细胞的周期分布，探究SMAD7对细胞周期的影响；结果（图3C）显示，Vector组和Lv-SMAD7组细胞的G0/G1期比例分别为（34.9±1.0）%、（32.3±1.9）%，而S期比例［（59.7±0.5）%vs（57.7±0.7）%］及G2/M 期比例［（5.4±0.8）%vs（10.0±1.3）%］组间差异均具有统计学意义（均P＜0.05）。

图3 SMAD7对KMS11细胞增殖的影响Fig 3 Effects of SMAD7 on proliferation of KMS11 cells

2.5 SMAD7 对经硼替佐米处理的KMS11 细胞耐药的影响

采用不同浓度的硼替佐米分别处理经Vector 或Lv-SMAD7转染的KMS11细胞，而后利用CCK8法检测细胞的D（450 nm）并计算存活率。结果（图4A）显示，在20、40、60、80 nmol/L硼替佐米的作用下，Lv-SMAD7组细胞的存活率均高于Vector 组（均P=0.000）。继而提示，过表达SMAD7 可降低KMS11 细胞对硼替佐米的药物敏感性。随后，根据上述预实验结果，选取40 nmol/L 的硼替佐米（细胞凋亡率在20%～30%），处 理 经Vector 或Lv-SMAD7转 染 的KMS11 细胞，利用流式细胞术检测细胞的凋亡情况。结果（图4B）显示，Lv-SMAD7组细胞的凋亡水平低于Vector组。

图4 SMAD7对经硼替佐米处理的KMS11细胞耐药的影响Fig 4 Effects of SMAD7 on resistance of KMS11 cells treated with bortezomib

3 讨论

目前，MM 的发病率呈逐年上升的趋势，虽然新型药物及治疗策略的应用已显著提高了患者的治疗反应率、无进展生存率和总生存率，但绝大多数MM患者仍面临耐药和复发的问题［6］。因此，寻找新的分子靶点以及为治疗MM 提供新的理论基础具有重要意义。

本研究借助生物信息数据库分析后发现，SMAD7在MM 中表达上调。随后，我们收集了8 例健康捐献者及20 例MM 患者的骨髓标本，qPCR 检测骨髓CD138+细胞中SMAD7mRNA 的相对表达，并分析其与患者临床资料的关系。结果发现，与健康捐献者相比，MM 患者SMAD7mRNA 相对表达较高且差异具有统计学意义；而SMAD7mRNA 相对表达与患者的临床资料间无显著相关性，究其原因，可能与样本量较小有关。

多项研究发现，SMAD7 具有调控细胞增殖、迁移、耐药等功能。SEHRAWAT 等［10］报道，条件性敲除小鼠胰腺β细胞的SMAD7后，β细胞的增殖受到抑制，提示SMAD7可促进细胞增殖。KLEEFF 等［11］研究表明，约有50%的胰腺癌患者的SMAD7mRNA水平较高，可消除胰腺癌细胞中TGF-β1 的生长抑制效应，从而增强肿瘤的生长、转移。此外，SMAD7的泛素降解可激活胶质母细胞瘤中的TGF-β 途径，并参与胶质瘤的上皮间质转化和化学治疗（化疗）耐药［12］。

本研究通过构建SMAD7 过表达的KMS11 细胞，于体外研究SMAD7 的生物学功能。结果显示，SMAD7能够促进KMS11细胞的活力、降低由硼替佐米介导的药物敏感性以及细胞凋亡水平；继而提示，SMAD7可促进MM细胞的增殖、耐药。

研究显示，SMAD7 可抑制TGF-β 信号通路的激活，并在甲状腺癌［13］、肺癌［14］、结直肠癌［15］等多种癌症的发生、进展中发挥功能，但其在MM中的作用机制尚不明确。BAUGHN 等［16］在原代MM 细胞及一系列细胞株中均发现，TGF-β 信号通路受阻。YU 等［17］报道，小鼠胚胎干细胞中的SMAD7 可通过依赖白细胞抑制因子（leukocyte inhibitory factor，LIF）的共受体糖蛋白130 激活信号转导及转录激活蛋白3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3） 通路，以维持胚胎干细胞的多能性。而STAT3 的激活与肿瘤的耐药性有关，研究［18］发现STAT3 通路激活抑制剂可增强骨髓瘤细胞U266 对化疗药物的敏感性。同时，ZHU 等［19］构建来那度胺耐药细胞株XG1LenRes 后发现，其STAT3 通路被组成性激活，使用小分子抑制剂BP-1-102 抑制活化的STAT3 蛋白进而可抑制该通路，使得XG1LenRes 可重新对来那度胺敏感。通过上述研究我们推测，在本研究中SMAD7 或可通过STAT3-SMAD7 途径来发挥MM 细胞的耐药作用。随后，我们检测了经Vector或Lv-SMAD7转染的KMS11细胞中STAT3蛋白的磷酸化水平，结果显示过表达SMAD7并没有增加KMS11细胞中STAT3 的磷酸化（阴性结果未在文中展示），即STAT3 蛋白均处于低磷酸化水平，该结果与ISHIKAWA 等［20］研 究 结 果 相 一 致；继 而 提 示，SMAD7 对KMS11 细胞增殖、耐药的影响可能与STAT3通路无关，因此其作用机制仍有待进一步探讨。

综上所述，本研究发现在MM 细胞中SMAD7呈现高表达，且过表达SMAD7 可促进MM 细胞的增殖、耐药；继而提示，SMAD7 可能是治疗MM 的有效靶点，且针对该相关作用机制仍需进行更深入的探索。

利益冲突声明/Conflict of Interests

所有作者声明不存在利益冲突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

伦理批准和知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究涉及的所有实验均已通过苏州大学附属第一医院科学伦理委员会的审核批准（文件号［2022］244）。所有实验过程均遵照《涉及人的生物医学研究伦理审查办法》的条例进行。受试对象或其亲属已经签署知情同意书。

All experimental protocols in this study were reviewed and approved by the Scientific Ethics Committee of the First Affiliated Hospital of Soochow University（Approval Letter No.［2022］244，dated 14/06/2022），and all experimental protocols were carried out by following the guidelines ofMeasures for Ethical Review of Biomedical Research Involving Humans.Consent letters have been signed by the research participants or their relatives.

作者贡献/Authors'Contributions

丁贺、何杨、杨剑峰参与了实验设计；丁贺、曹杨琳、魏星、杨剑峰参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意了最终稿件的提交。

The study was designed by DING He，HE Yang and YANG Jianfeng.The manuscript was drafted and revised by DING He，CAO Yanglin，WEI Xing and YANG Jianfeng.All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-03-07

·Accepted：2022-06-24

·Published online：2022-07-28