开发用于肿瘤微环境成像的pH敏感荧光探针

王雨心，孙瑞琪，刘坚华，何伟娜

上海交通大学基础医学院药物化学与生物信息学中心，上海 200025

癌症是全球性重大公共卫生问题，大部分癌症患者确诊即晚期，可选治疗方法有限且预后不佳，给个人、家庭和社会带来了巨大的负担［1-2］。因此，癌症的早发现、早诊断、早治疗至关重要［3］。肿瘤成像技术是癌症诊断必不可少的工具。近年来，具备高时空分辨率和低生物毒性的荧光成像技术开始逐步应用于在体成像领域。尤其是发射波长位于700～1 000 nm的近红外（near infrared，NIR）荧光成像技术，不但可以显著避免生物组织自发荧光和光子散射的干扰，且具有优越的组织穿透性，已成为肿瘤成像技术中的一大研究热点［4-5］。

普通的荧光探针在体成像时始终保持荧光信号的发射，因此无法很好地将正常组织（如肝、肾等）与肿瘤组织区分开，易产生“假阳性”的结果。为了实现肿瘤组织的特异性成像，采用肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）响应性荧光探针［6］是一个很有效的策略。肿瘤组织由于异常增殖、血液灌注不足及代谢失调，微环境组分发生改变，表现出乳酸增加、葡萄糖浓度降低、酸性升高、乏氧和免疫细胞募集等特征［7-10］。针对肿瘤组织间质pH值为6.4～7.0，而正常组织间质pH值为7.3～7.4这一差异，设计pH响应性荧光探针，使其在酸性环境中显示较强荧光，而在碱性环境中显示较弱荧光，以实现肿瘤组织与正常组织的差别化成像，将极大地提高肿瘤成像的信噪比和精准度。

目前，pH响应性荧光探针的母核结构大多为荧光素［11］、罗丹明［12］、氟硼吡咯［13］、萘酰亚胺［14］和花菁［15］等。其中，仅有花菁母核的吸收及发射波长范围位于NIR波段，在肿瘤成像研究领域备受关注［16-17］。花菁类荧光探针根据其所响应的最佳pH范围可分为2类：第一类探针响应于酸性-微酸性（pH＜7.0）环境［15，18-20］，而第二类探针响应于微酸性-中性（pH 6.4～7.4）环境［21-24］。其中，第二类探针对TME的响应更加灵敏，更适用于肿瘤成像。但是，已报道的微酸性-中性响应性花菁类探针普遍存在水溶性较差、缺少连接基团等问题。因此，开发具有连接基团、水溶性强、光学性能良好且pH响应范围与TME相符的花菁类荧光探针具有重要的研究意义。本研究拟合成水溶性pH响应性花菁类近红外荧光探针，并评估其光学性能，以期为该探针的肿瘤在体成像应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验细胞与动物

人宫颈癌细胞系HeLa、人结肠癌细胞系HCT-116 购自美国菌种保藏中心；6 周龄SPF 级BALB/c 雌性小鼠购自浙江维通利华实验动物技术有限公司。动物生产许可证号SCXK（浙）2019-0001，使用许可证号SYXK（沪）2018-0031。

1.2 主要试剂和仪器

2-氯-3-（羟基亚甲基）-环己-1-烯甲醛（上海安米克化学品有限公司），1-（5-羧基己基）-2，3，3-三甲基-3H-吲哚-5-磺酸内盐、6-（2，3，3-三甲基吲哚-1-鎓-1-基）乙酸溴化物（陕西金杰森茂生物科技有限公司），1-甲基哌嗪（TCI，日本），DMEM培养基、McCoy’s 5A培养基（上海源培生物科技有限公司），胎牛血清（Gibco公司，美国），CCK-8试剂盒（Dojindo研究所，日本），Hoechst探针（上海碧云天生物技术有限公司）。

pH 计（Mettler Toledo 公司，瑞士），CombiFlash®Rf200分离纯化制备色谱仪（Teledyne公司，美国），1260高效液相色谱仪（Agilent公司，美国），高分辨率质谱仪（AB SCIEX公司，美国），超高效液相色谱-四极杆质谱仪（Waters公司，美国），Avance Ⅲ400M核磁共振波谱仪（Bruker公司，德国），暗箱三用紫外分析仪（上海嘉鹏科技有限公司），紫外-可见分光光度计（上海棱光技术有限公司），稳态瞬态荧光光谱仪（Edinburgh公司，英国），EnSight多功能成像酶标仪（PerkinElmer公司，美国），激光共聚焦显微镜（Leica公司，德国），Smart-LF 紧凑型小动物荧光&生物发光成像系统（Vieworks公司，韩国）。

1.3 探针合成与结构表征

1.3.1 合成路线 在MYOCHIN等［24］合成的荧光探针（化合物1）的基础上，设计优化合成路线（图1）：在花菁类结构的两端吲哚氮原子上引入末端羧基修饰的长碳链；同时在两端吲哚芳环上引入磺酸基，构建探针R2S（化合物7）。此外，相对应的未引入磺酸基的探针R2Z（化合物8），作为对照也同时被合成。

图1 探针R2S与R2Z的合成路线Fig 1 Synthetic routes of the target probes R2S and R2Z

1.3.2 化合物5的合成与纯化 向10 mL 乙酸中加入化合物2 （1.06 g，3.0 mmol）、化合物4 （0.26 g，1.5 mmol）和乙酸钠（0.37 g，4.5 mmol）。110 ℃下，避光搅拌1 h。反应后，溶液由深棕色转变为墨绿色。冷却后，加入乙醚，静置待析出沉淀。弃去上清液后，加入超纯水溶解粗产物，通过C18柱层析进行纯化。用超纯水/甲醇进行梯度洗脱，收集含目标产物的组分。减压浓缩，冷冻干燥。

1.3.3 化合物6的合成与纯化 向10 mL 乙酸中加入化合物3 （1.06 g，3.0 mmol）、化合物4 （0.26 g，1.5 mmol）和乙酸钠（0.37 g，4.5 mmol）。110 ℃下，避光搅拌1 h。反应后，溶液由深棕色转变为墨绿色。冷却后，加入乙醚，静置待析出沉淀。弃去上清液后，加入二氯甲烷溶解粗产物，通过硅胶柱层析进行纯化。以二氯甲烷/甲醇（体积比20∶1）混合液为洗脱剂，收集含目标产物的组分，减压浓缩，真空干燥。

1.3.4 R2S 的合成与纯化 向10 mL N，N-二甲基甲酰胺（N，N-dimethylformamide，DMF）中加入化合物5（0.84 g，1.0 mmol）和1-甲 基 哌 嗪（445 μL，4.0 mmol）。在80 ℃、氩气保护下，避光搅拌4 h。反应后，溶液由墨绿色转变为深蓝色。冷却后，减压干燥，加入超纯水溶解粗产物，通过C18柱层析进行纯化。采用超纯水/甲醇对色谱柱进行梯度洗脱，收集含目标产物的组分。减压浓缩，冷冻干燥。

1.3.5 R2Z 的合成与纯化 向10 mL DMF 中加入化合物6（0.68 g，1.0 mmol）和1-甲基哌嗪（445 μL，4.0 mmol）。在80 ℃、氩气保护下，避光搅拌4 h。反应后，溶液由墨绿色转变为深蓝色。冷却后，减压干燥，加入二氯甲烷溶解粗产物，通过硅胶柱层析进行纯化。以二氯甲烷/甲醇（体积比20∶1）混合液为洗脱剂，收集含目标产物的组分，减压浓缩，真空干燥。

1.3.6 化合物的结构表征 对于纯化后获得的中间产物和最终产物，均通过质谱（mass spectroscopy，MS） 确定相对分子质量，通过磁共振氢谱（1H nuclear magnetic resonance spectroscopy，1H-NMR）鉴定结构，通过分析型高效液相色谱（high performance liquid chromatography， HPLC） 检 测纯度。

1.4 光谱学特性表征

取R2S、R2Z 分别溶于不同pH 值的磷酸盐缓冲液（sodium phosphate buffer，PBS），用紫外-可见分光光度计进行吸收光谱检测，稳态瞬态荧光光谱仪进行发射光谱检测。

基于发射光谱，读取探针R2S、R2Z 在质子化状态下最大发射波长（λEmmax）处对应的荧光强度数值（Imax），及不同pH 条件下探针于相应λEmmax处的荧光强度I，计算相对荧光强度（I/Imax），绘制探针的相对荧光强度对pH 值的响应曲线。在曲线上读取ΔI/Imax中值处对应的pH数值，即探针的酸解离常数（pKa）。

1.5 pH响应可逆性测试

取R2S、R2Z 分别溶于pH 3.68 的PBS，检测其吸收光谱；随后，滴加氢氧化钠溶液，将待测溶液的pH 值调至10.31，检测其吸收光谱；再滴加磷酸溶液将待测溶液pH 值调至3.68，检测其吸收光谱；最后，滴加氢氧化钠溶液，将待测溶液的pH 值调至10.31，再次检测其吸收光谱。

1.6 稳定性评估

1.6.1 光稳定性 取R2Z、R2S 分别溶于pH 4.48 和pH 9.47 的PBS，置于紫外光下持续照射，分别于第10、30、60 和120 min 时，检测各探针溶液的发射光谱。评估R2S、R2Z 在不同pH 条件下的光稳定性，并比较同一pH条件下R2S和R2Z的光稳定性差异。

1.6.2 结构稳定性 将完成吸收光谱检测的样品于37 ℃下避光放置，分别于第6、12和24 h时，检测各探针溶液的吸收光谱。评估R2S、R2Z 在不同pH 条件下的稳定性，同时比较同一pH 条件下R2S 和R2Z的稳定性差异。

1.7 细胞毒性实验

取对数生长期的人结肠癌HCT-116细胞和人宫颈癌HeLa 细胞，接种于96 孔板继续培养。待细胞贴壁后，将培养基更换为含有不同浓度的探针溶液或溶剂，孵育24 h 后，弃去原培养基，并用PBS 洗涤2次，加入含有CCK-8 的培养基，37 ℃孵育1 h，使用酶标仪测定各孔样品溶液在450 nm处的吸光度值。

1.8 细胞膜通透性检测

取对数生长期的HeLa 细胞，培养过夜后加入10 μmol/L 探针溶液，孵育2 h 后，用PBS 洗涤2 次。加入含有10 μg/mL Hoechst 的培养基孵育10 min，用PBS 洗涤2 次后，换新鲜培养基。在激光共聚焦显微镜下分别采用633 nm 激发波长，收集700～800 nm 通道下的荧光信号来观测合成探针的成像情况，以及采用405 nm 激发波长，收集430～470 nm 通道下的荧光信号来观测探针Hoechst的显像，辅助亚细胞定位。

1.9 NIR成像实验

1.9.1 体外NIR 成像 在48 孔板中，依次加入20 μmol/L 不同pH（6.00、6.50、7.00、7.50 和8.00）的探针溶液，采用740～790 nm 激发波长，收集810～860 nm通道下的荧光信号。

1.9.2 小动物NIR 成像初步探索 取2 只6 周龄BALB/c 雌性小鼠，通过尾静脉分别注射10 μmol/L的R2S 和R2Z 探针溶液，于 第10 min、1 h、4 h、20 h、24 h进行活体成像。

参考SHI 等［25］的方法，取1 只6 周龄BALB/c 雌性小鼠，于其背部左侧和右侧分别皮下注射pH 6.50和pH 7.40 的PBS，5 min 后在对应部位分别注射50 μmol/L的R2S探针溶液，进行活体成像。

1.10 数据处理

采 用Microsoft Excel、 GraphPad Prism 7.0 或Origin 2021 软件处理相应数据。采用GraphPad Prism 7.0 软件计算pKa和分析数据之间差异的统计学意义。数据之间的比较采用非配对t检验，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 化合物的结构鉴定

化合物5 为墨绿色固体，其分子结构（图1）通过1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）进行鉴定，各峰的化学位移δ（峰型，耦合常数J，氢的数目）为：12.02 （宽峰，2H），8.25 （双重峰，J=14.0 Hz，2H），7.80（单峰，2H），7.64（双重峰，J=8.4 Hz，2H），7.44（双重峰，J=8.4 Hz，2H），6.33（双重峰，J=14.4 Hz，2H），4.21 （三重峰，J=6.8 Hz，4H），2.70（三重峰，J=4.8 Hz，4H），2.20（三重峰，J=7.2 Hz，4H），1.85（多重峰，2H），1.74（多重峰，4H），1.67（单峰，12H），1.56（多重峰，4H），1.39（多重峰，4H）。分子量通过MS（ESI+）测试进行验证： 化学式为C42H50ClN2O10S2，［M+2H］+m/z理论值为843.26，测定值为843.36。

化合物6 为墨绿色固体。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）结果：δ 11.99（宽峰，2H），8.26（双重峰，J=14.0 Hz，2H），7.64（双重峰，J=7.6 Hz，2H），7.44（多重峰，4H），7.29（三重峰，J=7.2 Hz，2H），6.32（双重峰，J=14.4 Hz，2H），4.22（三重峰，J=6.8 Hz，4H），2.70（三重峰，J=5.6 Hz，4H），2.20（三重峰，J=7.2 Hz，4H），1.85（多重峰，2H），1.74（多重峰，4H），1.68（单峰，12H），1.55（多重峰，4H），1.39（多重峰，4H）。MS（ESI+）：化学式为C42H52ClN2O4，［M］+m/z理论值为683.36，测定值为683.41。

化 合 物7 （R2S） 为 深 蓝 色 固 体。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）结果：δ 7.68（单峰，2H），7.59（多重峰，4H），7.18（双重峰，J=8.0 Hz，2H），5.95（双重峰，J=12.8 Hz，2H），4.03（多重峰，4H），3.74（多重峰，4H），3.16（多重峰，4H），3.06（三重峰，J=4.8 Hz，4H），2.20（多重峰，7H），1.72（多重峰，6H），1.63（单峰，12H），1.54（多重峰，4H），1.35（多重峰，4H）。MS（ESI+）：化学式为C47H61N4O10S2，［M+2H］+m/z理论值为907.38，测定值为907.54。根据分析型HPLC峰面积检测化合物纯度为95.7%。

化 合 物8 （R2Z） 为 深 蓝 色 固 体。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）结果：δ 7.58（双重峰，J=12.8 Hz，2H），7.51（双重峰，J=7.2 Hz，2H），7.32（三重峰，J=7.8 Hz，2H），7.22（双重峰，J=7.6 Hz，2H），7.11（三重峰，J=7.6Hz，2H），5.90（双重峰，J=13.2 Hz，2H），3.99（多重峰，4H），3.72（多重峰，4H），2.61（多重峰，4H），2.46（多重峰，4H），2.33（单峰，3H），2.06（三重峰，J=5.8 Hz，4H），1.68（多重峰，2H），1.57（多重峰，16H），1.35（多重峰，4H），1.24（多重峰，4H）。MS（ESI+）：化学式为C47H63N4O4，［M］+m/z理论值为747.48，测定值为747.46。根据分析型HPLC峰面积检测化合物纯度为92.8%。

2.2 探针的pH响应性检测

通过对比在不同pH条件下探针溶液的吸收光谱和发射光谱，可以发现R2S、R2Z探针均具有明显的pH响应性。随着溶液酸性逐渐增强（从pH 11.10 到pH 3.47），R2S 和R2Z 的最大吸收波长（λAbsmax）分别由642 nm和662 nm红移至774 nm和760 nm（图2A、B），吸光度均明显增强。同时，R2S和R2Z的λEmmax分别由794 nm和790 nm红移至808 nm和804 nm（图2C、D），且荧光强度也均有明显升高。计算可得，R2S的斯托克斯位移（Stokes shift，即λEmmax和λAbsmax之间的差值）为64 nm，高于R2Z的斯托克斯位移44 nm（表1），说明R2S成像时发射光与激发光更易分辨，进而可更大程度地排除激发光的干扰。

表1 R2S与R2Z的光学参数Tab 1 Spectroscopic parameters of probes R2S and R2Z

图2 R2S与R2Z在不同pH值下的吸收光谱及荧光光谱Fig 2 Absorption spectra and fluorescence spectra of the probes R2S and R2Z at different pH values

通过探针R2S、R2Z 相对荧光强度对pH 值的响应曲线（图3），得到探针的pKa值分别为6.88、7.05，可以看出两者对微酸性-中性环境（pH 6.4～7.4）的变化反应灵敏，最佳响应范围与肿瘤所处环境相符，属第二类pH响应性荧光探针。通过pH响应曲线的斜率求得，R2S 的pH 响应灵敏度数值为0.361 7，明显高于R2Z（0.274 3）。

图3 R2S与R2Z在不同pH值下的相对荧光强度Fig 3 Relative fluorescence intensity of probes R2S and R2Z upon different pH values

2.3 探针的pH响应可逆性及稳定性

作为理想的pH 响应性探针，除了需要具有良好的光学性能，还需要具有较好的pH响应可逆性及稳定性。通过吸收光谱检测探针的pH响应可逆性，无论是将探针溶液由酸性调至碱性，还是由碱性调至酸性，R2S的吸收光谱变化在3个pH变化周期内都是完全可逆的（图4A）。但是R2Z仅表现出部分可逆性，当溶液pH由3.68调至10.31时，R2Z的吸收光谱在760 nm处出现一个新的吸收峰（图4B），说明有新的物质生成。为了更好地评估探针在体温（37 ℃）、不同pH条件的稳定性，采用荧光发射光谱检测探针的光稳定性，采用吸收光谱检测探针的结构稳定性（图4C、D）。结果发现R2Z在碱性（pH 9.47）条件下较为稳定，但在酸性（pH 4.48）条件下稳定性欠佳，而R2S无论在酸性和碱性条件下都显示出了较高的稳定性。

图4 R2S与R2Z的pH响应可逆性和稳定性Fig 4 Reversible changes toward cyclically adjusted pH and stabilities of probes R2S and R2Z

2.4 探针的细胞毒性评估

采用细胞（HCT-116细胞、HeLa细胞）毒性实验来评价R2S与R2Z探针的安全性。对比R2S高浓度给药组（100 μmol/L）与未给药组，2组之间差异无统计学意义（P＞0.05，图5A、C），说明探针对2种细胞没有表现出明显的生长抑制现象，具有良好的安全性。而应用R2Z处理HCT-116细胞，给药浓度为50 μmol/L时，与未给药组之间差异有统计学意义（P=0.007，图5B）；处理HeLa细胞，给药浓度为6.25 μmol/L时，与未给药组之间差异有统计学意义（P=0.009，图5D）。R2Z给药组在工作浓度（12.5 μmol/L）时，细胞相对存活率已降至80%以下，说明该探针的安全性低于R2S。

图5 R2S与R2Z对HCT-116细胞和HeLa细胞的毒性Fig 5 Cytotoxicity evaluation in HCT-116 and HeLa cells of probes R2S and R2Z

2.5 探针的细胞膜通透性测试

通过激光共聚焦显微成像可在633 nm 通道下观测到探针发出的荧光信号。对比R2S、R2Z 探针和Hoechst 发射荧光区域分布的异同，可以发现R2S 和R2Z 探针均主要分布于细胞质中（图6），表明2 种合成探针均具有良好的细胞膜通透性。

图6 R2S与R2Z的HeLa细胞成像Fig 6 Imaging of probes R2S and R2Z in HeLa cells

2.6 探针用于模拟TME的在体成像

使用小动物荧光成像系统检测在48 孔板中不同pH 条件下探针溶液的成像差异。在pH 6.00～8.00 范围内，R2S、R2Z 探针的荧光强度均随着pH 值的降低而升高，说明两者均具有较好的pH 响应性，且可观察到R2S的荧光强度高于R2Z（图7A～C）。

注射荧光探针的实验组小鼠饮食、活动正常，与未注射荧光探针的对照组小鼠状态无异。活体和离体成像实验结果表明R2S 主要分布于肝脏和肾脏，而R2Z 主要分布于肝脏（图7D）。在小鼠背部皮下注射pH 6.50 和pH 7.40 的PBS，模拟肿瘤和正常组织的微环境，随后注入R2S 后进行荧光成像（图7E）。在检测波长范围内pH 6.50侧的荧光强度明显高于pH 7.40侧（图7F），表明R2S 在模拟TME 的低pH 组织和正常pH组织中的成像具有明显的区分度。

图7 R2S与R2Z的体外与体内NIR成像Fig 7 In vitro and in vivo NIR imaging of probes R2S and R2Z

3 讨论

荧光基团经特定波段的激发光照射后，电子吸收光能跃迁至激发态后不稳定，随即返回基态并发射另一波长（通常为更大波长）的光，产生荧光信号。连有荧光基团的探针分子可以与被测物质相结合，借助光学成像手段来实现对被测物质的定性及定量分析。在众多不同结构的荧光基团中，花菁类荧光基团可通过改变其结构中共轭链的长度将其发射光谱范围拓展至NIR波段，非常适合用于肿瘤成像。然而，大多数已报道［18，21-22］的花菁类荧光探针稳定性欠佳，水溶性亦有待提高，同时其对肿瘤的选择性有限，且成像过程中正常组织的背景信号过高。上述问题大大限制了花菁类荧光探针的进一步开发和应用。

在本研究中，我们合成得到了纯度90%以上的水溶性pH 响应性花菁类NIR 荧光探针R2S。通过光谱学和NIR 成像检测，我们发现探针R2S 对微酸性-中性环境具有较好的pH响应性。正如所设计的那样，相较于R2Z，由于探针R2S中引入了磺酸基，其水溶性显著增强，细胞毒性明显降低，且仍保留了良好的细胞通透性。

此外，我们发现探针R2S在光学性能、稳定性和pH 响应可逆性方面，皆大大优于其脂溶性类似物R2Z。首先，在R2S 结构中，吲哚环上磺酸基的引入可使探针水溶性得以增强，而分子间堆积作用相应减弱，J 聚集体减少，Stokes 位移增大，量子产率增强［26-27］。其次，据我们推测，磺酸基的引入增大了单线态氧进攻的空间位阻，降低了单线态氧的进攻可能性［28］，使R2S展现出更为优异的光稳定性。此外，磺酸基是吸电子基团，将其引入至共轭结构中，可使共轭体系电子云密度下降，从而减少氢质子对化合物的亲电进攻，使探针R2S在酸性条件下的稳定性大大改善，而pH响应可逆性亦得以提升。

生物安全性和肿瘤特异性是肿瘤成像探针的重要评价标准。尾静脉注射探针R2S 后，小鼠行为正常，与细胞毒性实验结果共同证明探针具有较高的安全性。而通过皮下注射不同pH 的缓冲溶液来模拟“肿瘤组织”和“正常组织”微环境，原位注射探针R2S后的NIR成像结果表明“肿瘤组织”（低pH区域）呈现明显增强的荧光信号，说明该探针对肿瘤微酸性环境具有较好的特异响应性。综合以上两方面，该探针展现出应用于肿瘤成像的广阔前景。

在我们的设计中，R2S 探针的末端羧基提供了2个连接位点，可偶联靶向肽［29］、纳米颗粒［30］或其他分子，通过主动靶向或实体瘤的高通透性和滞留效应（enhanced permeability and retention effect，EPR），进一步加剧探针在肿瘤组织处富集，在TME特异性成像的基础上进一步提高肿瘤组织的信号强度及肿瘤成像的信噪比，以实现肿瘤的精准成像及癌症的精确诊断。

总之，本研究构建了一种性能优良的水溶性pH响应性花菁类NIR 荧光探针R2S。探针R2S 对pH 变化响应灵敏、稳定，最佳响应范围与肿瘤所处微环境的pH 相符，且水溶性佳、稳定性高、安全性好、具备共价标记的连接基团。该探针在肿瘤成像领域展现出了较强的在体成像应用潜力，为NIR荧光探针的设计与开发提供了新的思路和工具。

利益冲突声明/Conflict of Interests

所有作者声明不存在利益冲突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

伦理批准和知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究涉及的所有动物实验均已通过上海交通大学实验动物伦理与使用委员会的审核批准（文件号A2018027）。所有实验过程均遵照《医学实验动物管理实施细则》的条例进行。

All experimental animal protocols in this study were reviewed and approved by the Laboratory Animal Ethics and Use Committee of Shanghai Jiao Tong University （Approval Letter No. A2018027），and all experimental animal protocols were carried out by following the guidelines of theImplementation Rules for the Management of Medical Laboratory Animals.

作者贡献/Authors'Contributions

刘坚华、何伟娜、王雨心和孙瑞琪参与了实验设计；王雨心和孙瑞琪参与了化学合成、纯化和结构验证；王雨心进行了光谱测试、细胞毒性测试、成像实验和数据分析；王雨心、何伟娜、刘坚华参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意了最终稿件的提交。

The study was designed by LIU Jianhua，HE Weina，WANG Yuxin and SUN Ruiqi. WANG Yuxin and SUN Ruiqi carried out the chemical synthesis，purification and structural verification.WANG Yuxin performed the spectroscopy test，cytotoxicity study，imaging experiments and data analysis.The manuscript was drafted and revised by WANG Yuxin，HE Weina and LIU Jianhua.All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-03-19

·Accepted：2022-06-25

·Published online：2022-07-28