影响不明原因不孕患者体外受精-胚胎移植妊娠结局的多因素分析

林琳，刘芸，黄吴健，陈国勇

(福建医科大学福总临床医学院 联勤保障部队第九○○医院生殖医学中心，福州 320025)

随着社会与环境因素的变化，人们的生活方式也发生了明显改变，不孕人群的数量也越来越多。在不孕患者中有相当一部分的不明原因不孕(UI)，国外报道UI的发病率约8%～37%[1]。UI夫妇往往拥有正常的输卵管、正常的精液参数、正常的排卵功能，却缺乏可识别的不孕原因[2-4]。因诊断标准有分歧，UI相关的高水平的临床研究并不多。本研究通过回顾性分析UI女性患者在体外受精(IVF)助孕过程中临床特征，探讨相关因素对UI患者妊娠结局的影响，为改善UI患者的妊娠结局提供科学依据。

资料与方法

一、研究对象

回顾性分析2019年1月-12月于第九○○医院生殖中心首次行拮抗剂方案IVF/卵胞浆内单精子注射(ICSI)助孕的UI患者的临床资料。

纳入标准：(1)首次行拮抗剂方案治疗；(2)经腹腔镜检查或者输卵管造影证实至少有一侧输卵管通畅，并至少行3周期人工授精(IUI)未孕；(3)年龄<38岁；(4)月经规律，超声证实有正常排卵；(5)基础窦卵泡计数(AFC)>7个，抗苗勒管激素(AMH)>1.1 ng/ml；(6)男方精液未见明显异常。

排除标准：(1)排卵障碍的患者，如多囊卵巢综合征(PCOS)；(2)经腹腔镜或者输卵管造影提示存在盆腔因素，如盆腔子宫内膜异位症、输卵管梗阻或炎症、盆腔结核、生殖道畸形等；(3)男方中重度少弱畸精子症；(4)有自身免疫性疾病和遗传病史；(5)合并存在影响IVF妊娠结局的相关疾病，如子宫腺肌症、子宫肌瘤≥4 cm、未经治疗的输卵管积水、未经治疗的子宫内膜病变等；(6)未经治疗的内分泌疾病，如：甲状腺功能亢进，高泌乳素血症等；(7)夫妻双方存在任何一方有染色体异常的情况。

本研究共纳入UI患者147个周期(UI 组)，选择同时段和同年龄段就诊的输卵管阻塞因素(包含轻度的男方因素)不孕患者 341个周期为对照组。

二、研究方法

1.促排卵前准备：月经期第2～4天静脉采血检查血清促卵泡生成素(FSH)、促黄体生成素(LH)、雌二醇(E2)、孕酮(P)及AMH水平，近排卵期开始阴道超声监测卵泡发育至排卵，并记录AFC，排卵后1周左右开始行雌激素预处理至月经第2天早晨。

2.拮抗剂方案促排卵：月经第2天开始每天注射促性腺激素(Gn)，起始剂量150～225 U/d，适时调整Gn剂量，至最大卵泡直径达12～13 mm，和(或)E2水平超过1 468 pmol/L，和(或)LH>5 U/L时加用醋酸西曲瑞克(思则凯，默克雪兰诺，瑞士)0.25 mg/d至HCG日。当主导卵泡直径达18 mm时，当晚注射HCG(安徽丰原药业)6 000～10 000 U。

3.取卵及受精：注射HCG后36～38 h，经阴道超声引导下行穿刺取卵术。根据当天获卵情况，优先选择行IVF受精，受精后5～6 h，拆除部分颗粒细胞观察受精情况，若超过1/3的卵母细胞无受精征象，则进行补救ICSI受精。

4.胚胎培养及移植：按照本生殖中心的常规操作进行胚胎培养和评估[5]。再根据患者自身情况，选择取卵后第3天新鲜卵裂胚1～2枚移植或全胚冷冻。鲜胚移植及冻融胚胎移植(FET)后均按照本生殖中心常规行黄体支持治疗。

5.妊娠判断：胚胎移植14 d后测定血清β-HCG水平，若β-HCG>25 U/L，则确定为HCG阳性。移植后28 d行阴道B超检查，见孕囊者确定为临床妊娠，包括宫内妊娠和宫外妊娠。孕12周之前的胚胎丢失记为早期流产，孕12～28周的胚胎丢失记为中晚期流产。有胎儿活产(包括早产)者为活产周期。活产主要通过电话随访登记，电话随访至2021年12月。

6.观察指标：主要观察指标为成熟卵率、受精率、可移植胚胎率、优质囊胚形成率、补救ICSI发生率、鲜胚移植临床妊娠率、累积妊娠率及累积活产率。累积妊娠率=当次取卵周期后首次获得妊娠的例数(包括鲜胚移植与FET周期)/取卵周期数×100%。累积活产率=当次取卵周期后首次获得活产的例数(包括鲜胚移植与FET周期)/取卵周期数×100%。

三、统计学方法

结 果

一、两组患者的基本资料比较

本研究共纳入488个周期，包括147个UI周期患者和341个对照周期患者。两组患者间的年龄、不孕年限、BMI、bFSH、bLH、bE2、AFC及AMH水平比较均无显著差异(P>0.05)(表1)。

表1 两组患者的基本资料比较

二、两组患者的促排卵、胚胎发育及临床结局情况

1.两组患者的促排卵情况：分析结果显示，两组间的Gn用量、扳机日内膜厚度及激素水平和卵泡直径大于14 mm 数目以及获卵数等指标均无显著性差异(P>0.05)；UI组的MⅡ卵率显著低于对照组(P<0.05)(表2)。

表2 两组患者的促排卵结果

2.受精及胚胎发育情况：统计结果显示，与对照组相比，UI组的IVF受精率、囊胚及优质囊胚的形成率均显著降低(P<0.05)；UI组补救ICSI发生率有增加趋势，但差异尚无统计学意义(P>0.05)；两组的受精率、2PN受精率、2PN卵裂率、可移植胚胎率及D3优胚率均无显著性差异(P>0.05)(表3)。

表3 两组患者的受精及胚胎发育情况比较(%)

3.妊娠结局比较：两组的鲜胚移植临床妊娠率无显著性差异(P>0.05)；与对照组相比，UI组累积妊娠率显著降低(P<0.05)，累积活产率有降低趋势但尚无统计学差异(P>0.05)(表4)。UI组未获得活产尚有冷冻胚胎周期数是5例，占3.40%(5/147)，对照组未获得活产尚有冷冻胚胎周期数是15例，占4.40%(15/341)，两组之间无统计学差异(P>0.05)。

表4 两组患者的妊娠结局比较

三、影响UI患者妊娠结局的多因素Logistic回归分析

以妊娠结局为因变量(临床妊娠、活产赋值=1，无临床妊娠、未活产=0)，将临床认为与UI有关、单因素分析P<0.05的项目为自变量(年龄≤30岁=0，年龄>30岁=1)采用多因素Logistic回归，逐步法排除无关项目。最终分析结果显示：年龄是影响鲜胚移植临床妊娠的危险因素(P<0.05)，年龄>30岁UI患者行鲜胚移植临床妊娠的机会是年龄≤30岁UI患者的0.334倍；移植胚胎数是鲜胚移植临床妊娠的保护因素(OR=3.055，P=0.038)。优质囊胚数是UI患者累积活产的保护因素(OR=7.493，P=0.000)(表5)。

表5 影响妊娠结局的多因素Logistic回归分析

讨 论

随着晚婚晚孕、生活方式和环境因素的改变，越来越多的不孕患者寻求积极的治疗，其中UI患者的数量也在明显增加。抑郁、压力和焦虑的问题显著影响UI夫妻之间的感情。伴随辅助生殖技术的迅速发展，IVF-ET技术被认为是UI患者最后的医治方式，因其具有更高的妊娠率及活产率，也是最为有效的诊疗方案[6-7]。许多UI患者认为期待治疗是“浪费时间”，希望临床医生通过IVF技术来帮助其尽快成功妊娠[8]。指南[2]推荐应参照对生育需求急迫程度，结合女性年龄、不孕年限等要素，给患者定制个体化的诊疗方案。目前开展UI病因研究并不多，本研究通过单因素分析发现UI患者IVF-ET治疗过程中临床及实验室指标的特征，进一步探讨影响IVF妊娠结局的多因素来指导临床工作。

年龄是影响妊娠的重要因素，女性年龄超过30岁，自然妊娠的能力开始下降，35～40岁时显著下降。本研究多因素回归分析提示UI患者年龄>30岁是鲜胚移植临床妊娠的不利因素。指南[2]提出对于年龄小于35岁，不孕年限不足2年的UI患者，在6～12个月的期待治疗后，若未孕则建议积极治疗；而年龄大于35岁，不孕年限超过3年的UI患者推荐积极治疗。随着年龄的增长，卵巢储备功能下降，卵母细胞的数量及质量均下降。有研究显示UI女性较输卵管因素或男性因素的不孕女性卵巢储备功能下降[9-11]。本研究中，评估卵巢储备功能的指标FSH、AMH、AFC在两组中的结果相似(P>0.05)，可能跟选取年轻且卵巢功能正常的人群有关。卵母细胞数量对自然妊娠成功影响不大，但在IVF过程中却很重要，因为它们能影响累积结果[12]。卵母细胞质量差，在IVF治疗过程中可表现为成熟卵母细胞比例降低、卵母细胞形态异常、受精潜能低、胚胎发育不良、囊胚形成率低等。导致卵母细胞质量差的最常见原因是自然衰老，这与卵母细胞线粒体效率降低和氧化应激增加密切相关；在年轻女性中，散发性基因突变可加速卵母细胞衰老，导致胚胎发育的严重缺陷[13]。Astbury等[14]认为一些UI女性在IVF期间更容易产生不成熟的卵母细胞，这与卵母细胞质量较差有关，反映在高水平的DNA损伤，可导致植入率和活产率显著降低。因此卵母细胞的成熟，是成功受精及胚胎发育的基础，提高卵母细胞成熟比例，有助于提高卵母细胞利用率。吴锐等[15]研究认为改进卵母细胞体外成熟(IVM)技术，有助于提高卵母细胞的利用率，减少激素用量，及降低OHSS的发生风险。Haas等[16]研究认为GnRH激动剂(GnRHa)联合HCG双扳机可以增加卵母细胞的数量、成熟卵母细胞和优质囊胚的数量。本研究发现年轻UI患者卵母细胞的成熟比例较对照组降低，对于卵母细胞成熟度较差的患者，可考虑行卵母细胞体外成熟(IVM)技术，待卵母细胞发育至MⅡ期，再行IVF/ICSI受精，将形成的胚胎行移植/冷冻处理；或者下一取卵周期延长Gn天数，放大HCG日主导卵泡径线，或延长HCG扳机至取卵时间或在HCG日使用GnRHa联合HCG双扳机来增加卵母细胞的成熟比例。一项回顾性研究比较IVF与ICSI治疗UI患者的效果，发现两组患者受精失败率相当(P>0.05)，IVF组活产率显著高于ICSI组(P<0.05)，ICSI治疗增加了胚胎学家的工作量，同时也增加了患者的医疗费用，建议UI患者优先行IVF受精[17]。本研究选用的精液大致正常，取卵当天首先行IVF短时受精，若未受精的卵母细胞比例超过1/3，则进行补救ICSI。UI组IVF受精率显著降低(P<0.05)，补救ICSI发生率虽然不高(P>0.05)，但IVF结合补救ICSI，增加了部分UI患者卵母细胞的利用率，弥补了部分卵母细胞因质量缺陷导致的受精失败，使得两组患者受精率相当(P>0.05)。本研究UI组囊胚及优质囊胚的形成率均有显著降低(P<0.05)，考虑年轻UI患者胚胎发育的潜能下降。在Siristatidis等[18]的研究中UI患者与其他因素不孕患者相比较，临床妊娠率显著降低(P<0.05)，活产率有下降趋势(P>0.05)。本研究结果显示，UI组的累积妊娠率显著下降，累积活产率有下降趋势，与上述研究结果一致。Ebner等[12]认为年轻UI患者可能存在卵母细胞质量下降，表现为卵母细胞成熟比例降低、对受精潜力、胚胎发育产生负面影响。

本研究鲜胚移植选择1～2个优质卵裂胚，移植胚胎数目的增加有利于鲜胚移植临床妊娠，但同时也增加了多胎妊娠及产科风险。经过囊胚培养可以筛选出发育潜能更好的胚胎，同时囊胚移植提高了子宫内膜窗口期与胚胎的同步性，从而提高了活产率[19]。FET移植优选优质单囊胚，对于卵巢储备功能正常的<38岁的UI患者来说，弱化了年龄对累积活产的影响，使其不再是影响累积活产的主要因素。获得更多的优质囊胚可明显增加累积活产的机会。

综上所述，本研究排除了高龄、免疫等导致卵巢储备功能下降的情况，也排除了合并存在影响IVF结局的病理情况如子宫腺肌症、未经治疗的子宫内膜病变等，同时排除了中重度男方少弱畸精症导致的受精障碍，采用首次行拮抗剂方案的病例，避免混杂因素过多产生偏倚。两组病例未进行FET情况的比较，缺乏冻胚移植妊娠结局相关因素的分析，以后会逐步开展针对这部分的研究设计。UI患者存在潜在的累积活产下降的情况，可能与卵母细胞质量及胚胎发育潜能下降有关。年龄>30岁不利于UI患者鲜胚移植妊娠，增加移植胚胎数有利于鲜胚移植临床妊娠；优质囊胚数是年轻UI患者累积活产很好的预测因子，但如何增加患者优质囊胚数量是临床和实验室需要去共同探讨的问题。