不同饲料饲养的近暗散白蚁工蚁肠道中差异蛋白分析

苏丽娟, 赵鹏飞, 杜运良, 关宇梁, 郭瑞瑶, 阴正兴, 宋安东,*

(1. 河南农业大学生命科学学院, 郑州 450002; 2. 大坝(河南)工程技术有限公司, 郑州 450018;3. 河南牧业经济学院, 郑州 450046)

由于白蚁的等级多型性、共生微生物、生态位置和以木质纤维素为食的特殊能力，其长期以来吸引着生物学家和研究者为之着迷(Bignell, 2019; Vargo, 2019; Miura and Maekawa, 2020)。由于白蚁与肠道微生物互作及其营养生理和生态等因素使白蚁能够克服木头顽固的降解屏障，从而以木质纤维素为食，这些微生物包括真核原生动物、细菌和古菌，另外还有一些白蚁存在与巢真菌的外部共生关系(Brune, 2014; Bignell, 2019; Scharf, 2021)。白蚁的食性广泛，喜食腐殖化程度高的食物，主要包括枯木、杂草、枯枝落叶、有机质泥土等食物。其中木质纤维素通常是指50%～65%的碳水化合物(纤维素和半纤维素)、20%～25%的酚类(木质素、单脂醇及其他酚类)、～20%的其他成分如植物次生代谢物和很少量的蛋白(Lange, 2007; Scharf and Tartar, 2008)。其中对白蚁来说最难降解的是植物次生代谢物(包括多聚乙酰、生物碱、香豆素、糖苷、木脂素、黄酮类、二苯乙烯类、单宁类、萜类和环庚三烯酚酮等)，木质素和相关的酚类，以及结晶纤维素，但是白蚁肠道具有强大的解毒酶和抗氧化机制，可以用来降解这些有毒成分(Tartaretal., 2009; Sethietal., 2013; Friedmanetal., 2020)。关于碳水化合物，纤维素和半纤维素聚合物含有β-糖苷键，需要白蚁肠道内特异性的酶水解，这些酶包括内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、半纤维素酶、酯酶和其他糖苷水解酶(Sethietal., 2013; Scharf, 2015a)。另外，由于木材中的氮含量很低，仅有0.03%～0.10%，因此白蚁生长中所需要的氨基酸通过肠道内共生的固氮菌来解决(Bar-Shmueletal., 2020)。

迄今为止人们对白蚁消化生理的研究从对其胃肠道结构的理解发展到纤维素酶等相关酶和蛋白的解读，对肠道内蛋白的研究主要集中在木质纤维素酶的研究：一是从组学水平对木质纤维素酶进行鉴定和分析；二是对酶进行克隆、表达和酶学特性的分析，以期得到能够开发利用的酶。白蚁肠道内容物中受关注的木质纤维素酶最多，比如白蚁的后肠共生菌Trinervitermestrinervoides的宏基因组结果发现25个纤维素酶和半纤维素酶，包括14个糖苷水解酶家族蛋白，即8个GH5, 4个GH9, 以及2个GH13, GH2或GH10等，其中有内切纤维素酶、外切纤维素酶、木聚糖内切酶和α-岩藻糖苷酶等(Rashamuseetal., 2017; Wuetal., 2021)。文献报道有100多种经过PCR扩增再经过异源重组表达的白蚁或共生的消化酶，占据绝大多数的是糖基水解酶(glycosyl hydrolase, GH)(95%)，还有少数的酚氧化酶/木质素酶和酯酶。糖基水解酶主要包括GHF9(42%), GHF5(28%), GHF7(11%), GHF45(9%), GHF1(6%)和GHF11(2%)等(Scharf, 2015b)。

另外有研究报道不同食物导致白蚁肠道菌群数量、种类发生改变。例如，用草质和木质食物饲喂黄肢散白蚁Reticulitermesflaviceps，肠道菌群结构变化不大，但用农作物玉米秸秆饲喂时，菌群数量、种类都发生大幅度减少，可能是木头和玉米秸秆相比，其三素结合形式、含量都有很大差异，导致白蚁对食物喜好选择性不同，也证明白蚁对不同食物降解时存在底物特异性(Huangetal., 2013; Wangetal., 2016; Suetal., 2017)。又由于白蚁肠道内的木质纤维素酶一部分来源于白蚁自身，一部分由肠道微生物分泌，为白蚁降解木质纤维素的研究增加了复杂性和难度(Vargo, 2019)，因此对底物特异性降解的研究有待于进一步深入。本研究用3种饲料(松木、秸秆、滤纸)饲养近暗散白蚁Reticulitermesperilucifugus工蚁，通过双向电泳联合MALDI-TOF/TOF对比分析工蚁肠道前中肠和后肠蛋白质变化，确定白蚁工蚁肠道蛋白组成如何响应不同营养成分的变化，为进一步了解白蚁的营养消化吸收及其调控机理，也为挖掘白蚁生物系统中的高效降解酶提供参考。

1 材料与方法

1.1 白蚁采集及样品准备

近暗散白蚁采自河南省信阳商城县金刚台乡(31°76′N, 115°54′E)，采集到的白蚁首先进行物种鉴定，包括外部形态(黄复生等, 2000)和分子鉴定(彭一丁等, 2017)。然后在黑暗、25℃左右、相对湿度>50%的条件下饲养备用。取3龄以上的白蚁工蚁分3组(每组3个重复)，放入底部为1%琼脂、上面加入适量的松木(木质素18.5%，纤维素和半纤维素66.2%)、秸秆(木质素11.8%，纤维素和半纤维素62.3%)或者滤纸碎屑(纤维素和半纤维素99.9%)的塑料盒中饲养两周。取白蚁工蚁置于冰盒上，用解剖针从白蚁泄殖口轻轻拉出肠道，将其分为前中肠(前肠和中肠两段)和后肠两部分(图1)，分别装入2 mL Eppendorf管中，管内添加100 mmol/L PBS，5 mmol/L EDTA和1 mmol/L PMSF蛋白酶抑制剂1 mL，-20℃保存备用。不同饲料饲养时需要解剖的白蚁头数不同，松木饲养时前中肠需要约2 000头、后肠约1 000头，秸秆饲养时前中肠需要约3 500头、后肠约1 800头，滤纸饲养时前中肠需要约3 000头、后肠约2 000头。

图1 近暗散白蚁工蚁肠道解剖示意图

1.2 肠道及其内容物蛋白的提取和纯化

取前面解剖的2 mL Eppendorf管中近暗散白蚁工蚁肠道样品，4℃ 12 000 g离心15 min，上清置于另一2 mL Eppendorf管中。沉淀中加入200 μL蛋白提取液及研磨粉(美国Invent Biotechnologies公司)，研磨3 min，冰浴5 min，加入第一步上清液定量到2 mL，涡旋混匀。冰浴5 min后4℃ 12 000 g离心15 min，取上清(避开漂浮在上边脂肪层)。加50% TCA-冰丙酮(TCA-丙酮∶样品=1∶2, v/v)摇匀，-20℃放置10 min。之后转到4℃静置1 h左右，4℃ 13 000 g离心10 min。倒掉上清，扣至吸水纸上，控干液体。加冰丙酮冲洗3次，每一次需要涡旋仪震荡，使蛋白沉淀充分分散。3次冲洗间隔6 h，最后一次过夜，每次可见白色粉末状沉淀。冲洗完毕后，放干蛋白(一定要保证干燥，但不能放置时间过长，使其结块，影响蛋白水化)。之后加300 μL水化液，手动涡旋转速。水化时间定在8 h左右，放置在30℃恒温培养箱内，每隔1 h涡旋1 min。之后20℃ 22 527 g离心15 min，取上清。离心后根据Bradford法(1976)计算蛋白浓度。上样量在2 000 μg，溶液在100～200 μL之间。

1.3 双向电泳

蛋白样品置室温溶解，加入水化液(6 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，65 mmol/L DTT，4% CHAPS， 0.2% Bio-Lyte)充分混匀。用冷冻保存的线性IPG预制胶条(11 cm，pH 4-7)，室温放置10 min，沿着聚焦盘的边缘从左到右线性加入等量(体积和质量)的蛋白样品，蛋白样品加入时需要连贯，保证没有气泡，胶条放置时来回拉动使样品和胶条充分结合。胶条上方覆盖矿物油，加满聚焦盘，防止胶条水化过程中液体的蒸发。分清正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极(标有+)对应于聚焦盘的正极，对好正负极，设置等电聚焦程序。

等电聚焦程序为：电流保证不超过50 μA，S1 50 V主动水化12 h→S2 200 V线性1 h→S3 1 000 V快速1 h→S4 9 000 V线性2 h升压→S5 9 000 V聚焦8 h→S6 500 V快速，保持12 h，聚焦结束的胶条用超纯水润洗，轻轻冲去胶条表面矿物油，转移至平衡管中，加入5 mL平衡缓冲液A[50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8)，6 mol/L尿素，30%甘油，2% SDS，1% DTT(现加现用)，0.2%溴酚蓝溶液]，放上水平摇床上摇晃15 min。取出胶条后转移到平衡缓冲液B中[50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8)，6 mol/L尿素，30%甘油，2% SDS，1.5%碘乙酰胺(现加现用)，0.2%溴酚蓝溶液]，放上水平摇床上摇晃15 min。平衡完毕进行第二向SDS-PAGE电泳，配制12%分离胶和4%浓缩胶进行第二向SDS-PAGE电泳。恒温15℃，先用低电压100 V/3 W/10 min、后用180 V/12 W/3 h 40 min电泳，考马斯亮蓝R250溶液染色胶，冰乙酸脱色后凝胶成像。

1.4 生物信息学分析和MALDI-TOF/MS测序

染色后的凝胶用PD Quest软件分析图谱，比较不同饲料白蚁前中肠和后肠中差异蛋白的灰度值，确认其显著差异的蛋白(灰度比值大于1.5倍)。用双向电泳的至少2个标准蛋白质计算样品胶中蛋白质点分子量和等电点的实验值。选取差异表达蛋白点，用灭菌和去头的黄色枪头沿着染色边缘切下差异蛋白点放入Eppendorf管中，进行蛋白质酶解，即测序级胰蛋白酶Trypsin 溶液酶解，用串联飞行时间质谱仪(5800 MALDI-TOF/TOF, AB SCIEX)进行测试分析。

用MALDI-TOF/MS的数据采集软件Flexcontro 1 3.0对样品孔的数据进行采集，每孔取10个进行激光点击其不同位置。运用数据库World-2D PAGE, UniProt, ExPASy, NCBI和GenBank等对生物信息进行收集、加工、存储、分析与解析的方法来诠释实验的结果。

2 结果

2.1 肠道及其内容物蛋白点的丰度

2.1.1同种饲料饲养时前中肠和后肠中蛋白丰度比较: 近暗散白蚁工蚁用松木、秸秆和滤纸饲养的前中肠及其内容物蛋白的双向电泳图谱如图2(A, B, C)，后肠及其内容物蛋白的见图2(D, E, F)。用PD Quest软件分析发现，松木饲养时前中肠共有412个可辨蛋白点(图2: A),后肠共有301个可辨蛋白点(图2: D)，丰度值差异在1.5倍以上的有251个;秸秆饲养时前中肠共有351个可辨蛋白点(图2: B),后肠共268个可辨蛋白点(图2: E)，丰度值差异在1.5倍以上的有194个;滤纸饲养时前中肠共有395个可辨蛋白点(图2: C),后肠共296个可辨蛋白点(图2: F),丰度值差异在1.5倍以上的有201个。

2.1.2不同饲料饲养时肠道相同部位中蛋白丰度的比较：不同饲料饲养时近暗散白蚁前中肠对比(图2: A, B, C)发现，松木饲养与秸秆饲养相比差异蛋白点(差异点均为1.5倍以上的蛋白点)123个,松木饲养与滤纸饲养相比差异蛋白点106个,滤纸饲养与秸秆饲养相比差异蛋白点75个。对不同饲料饲养时近暗散白蚁后肠中差异蛋白对比(图2: D, E, F)发现，松木饲养与秸秆饲养相比差异蛋白点112个，松木饲养与滤纸饲养相比差异蛋白点93个，秸秆饲养与滤纸饲养相比差异蛋白点63个。

近暗散白蚁工蚁肠道双向电泳图谱结果显示相同饲喂条件时前中肠可辩蛋白点明显多于后肠；3种饲料饲喂时前中肠和后肠双向电泳图谱可辨蛋白点多少均依次是松木饲养>滤纸饲养>秸秆饲养；其中有21个相同蛋白点共同存在于6张胶图上，表达量虽有所变化，但均是丰度值高的蛋白。通过对比发现，饲料从用野外的松木变为滤纸时，工蚁前中肠和后肠的可辨蛋白点分别减少17和5个，而饲料从野外的松木变为秸秆时，工蚁前中肠和后肠的可辨蛋白点分别减少61和36个。

2.2 肠道及其内容物蛋白的鉴定和差异

根据饲养条件的不同、前中肠和后肠的差异，选取蛋白点丰度比值在1.5倍以上的胶点，同时避免选取存在有条纹和丰度很高的蛋白点进行扣点和MALDI-TOF/TOF鉴定分析，之后对蛋白质用UniProt和Swiss-Prot数据库进行分析。扣点部位如图2中红色数字所示，测序结果见表1。蛋白点测序结果按功能分别进行归类，主要为具有催化活性的蛋白、细胞组成蛋白和信号传导蛋白(图3)，其中前中肠和后肠均是具有催化活性的蛋白最多，分别占45.65%和48.28%，包括碳代谢、糖酵解、纤维素降解和丙酮酸代谢相关酶等；细胞组成蛋白次之，分别是34.78%和37.93%。

图2 木质纤维素含量不同的3种饲料饲养的近暗散白蚁工蚁前中肠和后肠内容物的双向电泳图谱

通过对差异蛋白的分析发现，不同饲料饲喂的近暗散白蚁前中肠和后肠的主要差异蛋白质为具有催化活性的蛋白质，这些蛋白质包括与氨基酸代谢、丙酮酸代谢、碳代谢、TCA循环、糖酵解、糖异生、氮代谢、纤维素降解相关的酶及一些具有其他催化活性的蛋白质(图3)。松木饲养时前中肠上调的蛋白质有38个，后肠上调12个；秸秆饲养时前中肠和后肠上调的各有7个；滤纸饲养的前中肠上调的有2个，后肠上调的有10个(表1)。

表1 近暗散白蚁工蚁用不同饲料饲养时肠道及其内容物差异蛋白的MALDI-TOF/TOF鉴定结果

图3 双向电泳鉴定的木质纤维素含量不同的3种饲料饲养的近暗散白蚁工蚁肠道蛋白质分类

其中,松木饲养时前中肠上调的蛋白有腺苷酸琥珀酸裂解酶(图2中A1)、苹果酸脱氢酶(A6)、二氢硫辛酸脱氢酶(A7)、烯醇化酶(A8)、丙酮酸脱氢酶E1(A11)、磷酸丙糖异构酶(A15)、唾液纤维素酶(A28)和磷酸甘油酸变位酶2(A44)等;滤纸与秸秆饲养前中肠均上调的有热激蛋白70(A5)、伴侣蛋白DnaK(A5)、DNA聚合酶delta催化亚基(A22)、过氧化氢酶(A25)和碳酸酐酶(B7)等。

松木饲养时后肠上调的蛋白有热激蛋白70(D1)、伴侣蛋白Dnak(F9)、碳酸酐酶(A13)和异柠檬酸脱氢酶(D6)等；秸秆饲养时后肠上调的蛋白有碳酸酐酶(B7)、蛋白酶α亚基(E4)和内切葡聚糖酶(E9)等； 滤纸饲养时后肠上调的蛋白有醛酮还原酶(F2)、蛋白酶β亚基(F3)、过氧化物酶1(F7)、伴侣蛋白Dnak(F9)、苹果酸酶(F11)和羧酸酯水解酶(F12)等。

3 讨论

白蚁可以将难以降解的木质纤维素作为其食物来源，其肠道内的内源性酶或共生菌分泌的酶协同将食物的纤维素和半纤维素成分分解转化为葡萄糖和戊糖，这些单糖再由白蚁或共生菌吸收进行身体必需的代谢(Brune and Ohkuma, 2011)。但是由于木材中的纤维素、半纤维素和木质素的结构和含量不同，导致白蚁饲用不同的食物时，肠道内微生物的组成发生变化(Bouciasetal., 2013; Huangetal., 2013; Raychoudhuryetal., 2013)。本研究发现，近暗散白蚁用不同营养成分的饲料饲养时，其肠道内的蛋白可辨胶点数量也发生变化，依次是松木饲养的工蚁>滤纸饲养的工蚁>秸秆饲养的工蚁，3种条件下前中肠蛋白质可辨胶点明显多于后肠；在从野外的松木变为滤纸时，其前中肠和后肠的可辨胶点的减少数明显低于从松木变为秸秆(图2)。另外饲养实验中还发现用滤纸和秸秆饲养时，白蚁体型变小。综合分析白蚁的饲养、肠道微生物和蛋白的结果，推测由于秸秆和松木的结构成分不同，用秸秆饲养时，其肠道内的蛋白成分、微生物组成改变，导致其生长明显受阻。而滤纸由于缺少木质素，结构松散，纤维素酶容易结合，白蚁对它的适应相对较好，但是和秸秆相比，由于成分单一，导致白蚁的肠道微生物、蛋白结构及生长均介于松木和秸秆中间。

一直以来，大家认为白蚁降解木质纤维素主要是依赖其后肠内共生的细菌和原生动物，由共生物分泌的酶参与木质纤维素的降解和其他代谢过程(Bignell, 2011; Hongoh, 2011; Ni and Tokuda, 2013)。但越来越多的转录组、基因组和重组酶的证据诠释了白蚁自身分泌的酶的协同消化能力(Scharf and Tartar, 2008; Scharf, 2015a)，根据这些不断深入的研究，我们理解白蚁通过肠道内数十种酶的共进化进行协同消化，这些酶包括纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、磷酸酶和辅助酶(漆酶、醛酮还原酶等)(Scharf, 2015b)。因此本实验得到了115个蛋白点的测序结果，这里面具有催化活性的蛋白占比将近一半，包括与氨基酸代谢、丙酮酸代谢、碳代谢、糖代谢和氮代谢等相关的酶。

通过对松木、滤纸和秸秆对近暗散白蚁前中肠和后肠的蛋白表达的影响，发现松木饲养前中肠上调的蛋白质有参与氨基酸代谢、碳代谢及三羧酸循环的酶(表1)，这些酶都是白蚁及其肠道共生物生存必需的酶。比如腺苷酸琥珀酸裂合酶主要参与嘌呤代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，这些氨基酸都是一些常见的生糖氨基酸(Zurloetal., 2019)。苹果酸脱氢酶和二氢硫辛酸脱氢酶主要进行丙酮酸代谢和碳代谢，丙酮酸在三大营养物质的代谢联系中起着重要的枢纽作用(Moonetal., 2015)。线粒体丙酮酸脱氢酶E1进行TCA循环，此循环为白蚁机体提供能量的同时，也为其他代谢提供中间产物(Vastanoetal., 2014)。磷酸丙糖异构酶是一种能够催化丙糖磷酸异构体在二羟丙酮磷酸和D型甘油醛-3-磷酸之间转换的酶，主要进行糖酵解和糖异生代谢，此代谢通路不但能释放能量，也能让机体在逆境条件下应对环境胁迫(Rodríguez-Bolaos and Perez-Montfort, 2019)。唾液纤维素酶主要在木质纤维素酶降解初级阶段随机水解非结晶区的纤维素，且只在松木饲养前中肠发现，这可能与底物特异性有关，证明此酶可以很好地和松木结合。另外还有一些参与醛类、芳香类等木质素降解中产生的有毒成分的解毒蛋白，比如线粒体醛脱氢酶(ALDH2)具有脱氢酶和酯酶等多种酶功能，ALDH2在辅助因子NADP+的参与下将醛类物质脱氢成为相应的羧酸，对减轻醛类物质对机体的毒性作用具有重要意义(Dingetal., 2019)。

热激蛋白70参与应激反应，超氧化物歧化酶可以减少木质素消化时产生细胞色素的自由基，可以清除白蚁体内由木质素降解产生的有害代谢物(Fetherolfetal., 2017)。在滤纸与秸秆饲养的近暗散白蚁工蚁前中肠中热激蛋白70、伴侣蛋白DnaK、过氧化氢酶均上调(表1)，表明白蚁的饲料有野外的松木变为秸秆或者滤纸后，白蚁都需要动员体内的应激蛋白来响应饲料的变化。秸秆饲养时前中肠上调的蛋白质碳酸酐酶具有调节体液pH的作用，同时参与氮代谢通路(Lindskog, 1997)，可能是白蚁需要合成更多的氮素以应对饲料的变化。

内切葡聚糖酶只在秸秆后肠饲养中表达，可能是改变白蚁饲料来源后，针对秸秆，白蚁自身通过合成之前未表达过的内切葡聚糖酶降解纤维素，表明白蚁面对不同饲料可以改变木质纤维素酶系组成。滤纸饲养后肠上调的蛋白有醛-酮还原酶、苹果酸酶和羧酸酯水解酶等，其中醛-酮还原酶具有多种功能，参与包括戊糖和葡萄糖醛酸酯互变、果糖和甘露糖代谢、半乳糖代谢，同时也是白蚁体内的解毒酶，这可能在滤纸消化过程中后肠主要对半纤维素起降解作用(Penning, 2015)。苹果酸酶进行丙酮酸代谢和碳代谢，羧酸酯水解酶主要是催化酯、硫酸酯和酰胺的水解(Chenetal., 2016)，这些蛋白的上调可以推测，由于滤纸中只有纤维素没有木质素，相对于难于降解的木质素，白蚁的后肠根据饲料成分调整消化酶的组成，主要进行半纤维素代谢和纤维素代谢。

为了研究白蚁对木质纤维素的降解，我们分别比较了近暗散白蚁用不同饲料饲喂时肠道不同部位内容物的蛋白组成和含量的变化，发现相同饲料饲喂时，前中肠和后肠蛋白的组成有较大差异；不同饲料也影响白蚁肠道内的蛋白组成，秸秆和滤纸饲喂相对于野外的松木食物，肠道蛋白组成差异较大，尤其是秸秆饲喂影响更大，其中差异的蛋白最多的是具有催化活性的蛋白，因此饲料成分是其肠道蛋白变化的主要原因。这些结果为揭示白蚁的营养消化吸收机理，也为挖掘白蚁生物系统中的高效降解酶提供了参考。