结膜松弛症球结膜成纤维细胞的原代培养及形态学观察

麻 凯，刘 江，王亚卉，池华博文，项敏泓

作者单位：1(200062)中国上海市，上海中医药大学附属普陀医院眼科；2(200082)中国上海市，上海中医药大学附属上海市中西医结合医院眼科

0引言

结膜松弛症(conjunctivochalasis，CCH)是临床常见的眼表疾病，它是由于球结膜过度松弛和(或)下睑缘张力升高，致使松弛的球结膜堆积在眼球与下睑缘、内眦部、外眦部之间形成皱褶，引起眼表泪液学微环境异常，常伴有眼部干涩、异物感、溢泪等不适症状的一种年龄相关性眼病，影响患者的视觉和生活质量[1-3]。目前对结膜松弛症的发病机制尚无明确定论，学者认为结膜松弛症主要与结膜组织中基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)与基质金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)两者之间的失衡[4-5]、弹力纤维降解[6]、细胞衰老[7-9]等致病因素有关。成纤维细胞是疏松结缔组织中的主要细胞，它不仅合成和分泌多种胶原蛋白和弹性蛋白，生成胶原纤维、网状纤维和弹性纤维，还能分泌细胞外基质，是结膜组织中的重要成分之一[10-12]。自 De Falco等[13]报道体外成功提取人Tenon囊原代成纤维细胞以来，关于CCH的实验研究进入了新的阶段。但结膜成纤维细胞的原代提取及稳定传代对于初学者而言仍较为棘手，失败率相对较高，因此有必要建立一种更加完善和高效的培养方法。本研究旨在通过原代培养、纯化及鉴定，观察不同培养时期内CCH球结膜成纤维细胞的生长状况及形态学变化，明确其生长周期，以期体外获得稳定、一致的CCH球结膜成纤维细胞，从而为CCH发病机制的研究及寻求切实有效的治疗方法搭建平台。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1标本收集结膜组织取自2021-03/06于上海中医药大学附属普陀医院眼科确诊为CCH Ⅲ级[14]且符合手术指征的患者6例10眼，年龄65～83(平均74.35±1.57)岁，其中2例3眼合并糖尿病病史。纳入患者均行详细的眼部检查和手术评估，排除青光眼、睑缘炎、角结膜疾病(结膜炎、角膜炎、角结膜肿瘤等)、泪囊炎、泪道阻塞等其他眼部疾病，由同一术者采用经典的松弛结膜新月形切除术进行手术[15]。本研究已通过上海中医药大学附属普陀医院伦理委员会批准(No.PTEC-A-2021-14-1)，所有患者均签署知情同意书。

1.1.2主要试剂及仪器DMEM细胞培养基(美国Hyclone公司)；青霉素-链霉素溶液、0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液、胎牛血清(美国Gibco公司)；波形蛋白(Vimentin)单克隆抗体(ab137332)(英国Abcom公司)；4%多聚甲醛固定液、免疫染色通透液(Triton X-100)、抗荧光淬灭封片液、山羊血清、Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG(H+L)二抗(A0208)(上海碧云天生物科技有限公司)。CO2培养箱(Thermo公司)；超净工作台(苏净安泰公司)；倒置光学显微镜(日本Olympus公司)；低温高速离心机(德国Eppendorf公司)；离心机(长沙湘仪公司)；酶联免疫检测仪(Bmg Labtech公司)；荧光显微镜(德国Leica公司)；高精确电子分析天平(德国Sartorious公司)。

1.2方法

1.2.1原代细胞培养无菌条件下取手术切除的松弛结膜组织，生理盐水冲洗祛除血污，立即放入装有完全培养基的1.5mL EP管中，低温保存，采用组织块贴壁法行原代球结膜成纤维细胞的分离培养。超净工作台中用眼科显微剪修剪结膜组织约1mm×1mm大小，移入25cm2培养瓶中，将结膜组织平铺于培养瓶底，待其微微干燥时，贴壁缓缓加入5mL含体积分数10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素、1%生长因子的DMEM完全培养液，勿使组织浮起。将培养瓶置于37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中静置培养，每2～3d换液1次，倒置显微镜下观察并拍照记录。

1.2.2细胞传代观察CCH球结膜成纤维细胞生长特性，组织贴壁细胞生长到第8d时行消化、传代。超净工作台中取出培养瓶，弃去培养基，加入1mL PBS洗涤，轻轻晃动，弃去PBS，再加入1mL 0.25%胰蛋白酶(EDTA)后静置2min，倒置显微镜下观察。当细胞质出现回缩，细胞变圆呈球形，细胞连接松散或有成片的细胞浮起时，表示消化时间适合，立即加入1mL完全培养基终止消化。离心管离心，见其底部乳白色细胞团块，弃去上清液，加入1mL完全培养基，轻轻吹打制成均匀的细胞悬液，接种于6孔板，置于细胞培养箱中。每2～3d换液1次，待细胞铺满瓶底后再用同样方法消化传代。

1.2.3细胞形态学观察倒置显微镜下定期观察，记录CCH结膜组织贴壁后第1、2、3、5、7、9、12、15d细胞的生长状态及形态变化，注意防止污染，控制拍照观察时间，以防离开培养箱时间过长进而影响细胞生长。

1.2.4细胞鉴定取第4～5代生长良好的CCH结膜成纤维细胞行胰蛋白酶消化，制成细胞悬液，常规铺板培养，待细胞完全贴壁时行免疫荧光染色。吸出原培养液，加入PBS溶液轻轻晃动，洗3遍，每次3min，室温下加入4%多聚甲醛固定20min，PBS溶液洗涤，0.5% Triton X-100溶液破膜30min，5%山羊血清封闭，加入Vimentin单克隆抗体(1∶500)，4℃冰箱孵育过夜；次日PBS洗涤后，加入Alexa Fluor 488荧光标记山羊抗兔IgG(H+L)二抗(1∶500)室温避光孵育60min，PBS洗涤3次，DAPI染核5min，甘油明胶进行封片，荧光显微镜下拍照。

2结果

2.1CCH成纤维细胞的形态学观察第1d，CCH结膜组织周围有细胞逸出，表现为胶状样逸出带，细胞较小，紧密排列，圆形或椭圆形，呈铺路石样分布，细胞轮廓不清晰；第2d，组织周围胶状样细胞逸出带较前明显扩大，细胞融合成片并彼此连接成网状，大小不一，排列不规则；第3d，细胞逸出带较前进一步扩大，组织边缘细胞生长较密集，细胞平行排列呈束带状、放射状，周围细胞分布相对疏松，部分细胞呈长梭形或多角形，可见伪足形成并向外逐渐伸展；第5d，细胞轮廓逐渐清晰，可见卵圆形细胞核，细胞核边界清楚，细胞从组织周围呈岛状生长爬出，岛中心的细胞排列较紧密，多呈编织状、鱼群状排列；周围细胞排列相对疏松，相互交织成网状，有较大的细胞间隙，长梭形细胞形态逐渐明显；第7d，结膜组织透亮度高，细胞分布均匀，数目较多，胞体大小适中，细胞核明显甚至双核，细胞质清晰无空泡，细胞轮廓清晰、饱满，形态规则；第9d，组织块颜色加深，但未见黑化，细胞形态较模糊，细胞表面可见混浊、颗粒状及深黄色的碎屑，其为细胞的分泌物或衰老的细胞器；第12d，组织块边缘部分黑化，组织周围可见折光性较强的细胞碎片，细胞排列相对疏松，体积大而扁平，形状不规则，细胞浆内可见空泡与颗粒，细胞透亮度降低；第15d，组织块完全黑化，细胞老化，边界模糊，细胞扁平呈铺展状生长，细胞浆内有大量颗粒状物质和小泡产生，部分细胞开始从培养瓶底脱落，细胞之间出现较大空隙(图1)。

图1 不同时期CCH球结膜成纤维细胞形态学观察 A、B：第1d，组织周围有细胞爬出，细胞较小，紧密排列，呈铺路石样分布；C、D：第2d，细胞较前明显增多，细胞融合成片并彼此连接成网状；E、F：第3d，细胞较前进一步增多，组织边缘细胞生长密集，周边相对稀疏；G、H：第5d，细胞轮廓逐渐清晰，边缘细胞有较大的间隙，长梭形细胞形态逐渐明显；I、J：第7d，细胞分布均匀，数目较多，胞体大小适中，轮廓清晰，形态规则；K、L：第9d，组织块颜色加深，细胞表面见混浊、颗粒状及深黄色的碎屑堆积；M、N：第12d，组织块边缘部分黑化，胞体大而扁平，细胞浆内可见空泡与颗粒；O、P：第15d，组织块完全黑化，部分细胞从培养瓶底脱落，细胞间出现较大空隙。

2.2传代后CCH球结膜成纤维细胞形态学观察传代后细胞呈细长梭形、扁平星状或多突的纺锤形，中间稍宽大，两头相对细小，有卵圆形的细胞核，伴向外伸出2～3个长短不同的细长突起，细胞密度均匀，排列规则，大小基本一致(图2)。

球结膜成纤维细胞体外培养的主要方法有组织块贴壁法和酶消化法[16-17]。酶消化法多选择胰蛋白酶或胰蛋图2 传代后CCH球结膜成纤维细胞形态学观察 A：第4代CCH球结膜成纤维细胞；B：第5代CCH球结膜成纤维细胞。

2.3CCH球结膜成纤维细胞免疫荧光鉴定对球结膜成纤维细胞标记性蛋白Vimentin进行免疫荧光染色鉴定，结果显示球结膜成纤维细胞的细胞浆内可见绿色荧光，呈阳性反应，细胞核呈蓝色荧光(图3)。

图3 CCH球结膜成纤维细胞标记性蛋白免疫荧光染色 A：Vimentin免疫荧光染色；B：细胞核DAPI染色；C：Merged。

2.4原代培养失败的CCH球结膜成纤维细胞形态学表现部分原代培养的结膜组织贴壁良好但未见细胞从组织周围爬出，选取原代培养失败的不同时间点观察组织形态学变化见图4。

图4 CCH球结膜成纤维细胞原代培养失败的形态学观察 A：第1d，组织贴壁，组织周围未见细胞爬出；B：第3d，组织形态较前未见明显变化，周围未见细胞爬出；C：第7d，组织呈棕黄色，组织周围未见细胞爬出；D：第15d，组织块完全黑化，组织失去活性。

3讨论

白酶与胶原酶联合消化，但酶处理组织时间和酶浓度难以掌控，消化时间过长或酶浓度过高均可导致细胞活性下降，进而影响细胞的爬出与贴壁，且酶消化解离细胞的过程中容易导致细胞壁破损，使原代细胞状态受到影响，对细胞生物学特性损伤较大，不利于细胞的传代与后续实验[18]。而组织块贴壁法简单易行，只需1～2mm2大小组织即可获取大量稳定的成纤维原代细胞，同时又可避免消化酶对细胞的化学损伤，培养的细胞均质性与稳定性较好，也避免由于酶的长时间作用造成细胞损伤或遗传特性改变。通过差速贴壁消化祛除结膜成纤维细胞中混合的结膜上皮细胞，传至3代及以上即可得到纯度相对较高且稳定的结膜成纤维细胞系[19-20]。既往研究主要确定了合适的细胞培养基及细胞鉴定方法，但对于原代成纤维细胞的传代时间及不同时期的形态学观察尚未见相关报道。

成纤维细胞原代培养过程中，因细胞增殖生长达到一定密度后，细胞之间会出现接触抑制现象，细胞的生长、分裂速度会逐渐减慢甚至停止，如不及时进行消化和传代，细胞会出现衰老甚至死亡。原代细胞消化传代的频率和时间间隔与接种细胞的种类、细胞生物学特性以及培养基性质等多种因素有关[21-22]。本研究通过组织块贴壁法对CCH结膜成纤维细胞进行体外培养，发现CCH球结膜组织接种于培养瓶24h后即可见组织周围有细胞逸出；第2～7d为球结膜成纤维细胞生长的对数期，此时可见细胞轮廓逐渐清晰，分布逐渐均匀，数目逐渐增多，中心生长的细胞排列相对紧密，呈放射状、栅栏状及鱼群样生长；周围细胞排列较疏松，细胞呈纺锤形、扁平状分布；第9～15d为细胞生长的平台期，细胞增长缓慢，排列疏松，体积变大，形状扁平，呈圆盘状分布，部分细胞从培养瓶底部脱落，细胞之间出现较大空隙，且结膜组织透亮度逐渐降低，颜色加深，至组织块黑化。与既往皮肤及肝脏成纤维细胞生长特性的研究相一致，符合成纤维细胞的生长规律[23-24]。本研究发现，组织贴壁后细胞平均生长时间为第8d时行消化传代，传代后细胞生长速度较快，形态规则，呈典型细长梭形，并伴有2～3个长短不一的突起，与目前所公认的成纤维细胞的形态学表现相符[25]。因此，根据上述球结膜成纤维细胞的生长周期及消化传代后的生长状况，原代细胞培养至第8d时行消化传代，可获得最佳的细胞状态，且细胞数目相对较多，细胞的生物学特性能较稳定地传递下来，符合后续实验的细胞数量要求。

Vimentin是成纤维细胞特异性高表达的一种蛋白，广泛参与组织与细胞的修复和再生，包括细胞增殖、迁移、细胞外基质重塑及免疫反应等[26]。因此，Vimentin可作为成纤维细胞的一种标志性蛋白，并通过免疫荧光实验技术进行成纤维细胞的鉴定[27-28]。Budel等[29]通过细胞免疫荧光检测成纤维细胞标志性蛋白Vimentin染色呈绿色，DAPI染核呈蓝色，证实为成纤维细胞。本研究通过免疫荧光染色发现CCH球结膜成纤维细胞标志性蛋白Vimentin染色结果为阳性，且符合成纤维细胞的形态学特征，证明本研究通过组织块贴壁法所提的原代细胞为球结膜成纤维细胞。

然而，CCH球结膜成纤维细胞原代培养过程并非一帆风顺，实验中出现组织块贴壁良好但始终未见细胞爬出。分析其失败的原因可能有以下几点：(1)患者年龄相对较大且合并多种基础疾病，如糖尿病等，结膜组织活性相对较低；(2)取材后结膜组织块未及时放入含培养基的EP管中低温保存，暴露空气中时间过长使组织失去活性；(3)平铺组织操作时间过长，组织过于干燥，脱水而失去活性；(4)实验操作不规范，结膜组织取材后未及时清洗致组织污染，影响细胞爬出；(5)未及时更换培养液，培养过程中产生的有害代谢性物质堆积阻碍细胞爬出。 成纤维细胞培养过程中经历多次失败，总结经验得出：(1)取材尽量选取相对年轻且无基础代谢性疾病(如糖尿病等)的患者；(2)取材后，无菌生理盐水冲洗结膜组织以祛除血污，并立即放入含完全培养基的EP管中冷藏，否则组织活性降低影响成纤维细胞的爬出；(3)超净工作台中尽快完成结膜组织贴壁，勿使组织过于干燥，贴壁后缓缓加入完全培养基，以覆盖组织为宜；(4) 贴壁后12h内尽量不要移动培养瓶，以免晃动引起组织块漂浮，24h后可取出观察并拍照记录。如此操作，即可获得均一、稳定的原代球结膜成纤维细胞。

综上，本研究采用组织块贴壁法分离提取原代CCH球结膜成纤维细胞，通过观察成纤维细胞生长周期发现，当细胞爬出平均时间为第8d时行消化传代最优，并通过差速贴壁法纯化成纤维细胞可获得稳定、一致的CCH球结膜成纤维细胞，为CCH发病机制的研究及寻找切实有效的治疗方法创造了良好的实验平台。