纳米二氧化钛对蚕沙细菌群落结构及其多样性的影响

莫丹梅 蓝黄丽 李国力 杨文琪 徐开遵

(广西大学农学院， 南宁 530004)

蚕沙是蚕业生产的大宗副产物之一，每生产100 kg蚕茧可得600 kg风干蚕沙[1]。蚕沙富含有机物质及各种养分元素[2]，可发酵成有机肥应用于农业生产。然而，蚕沙也是家蚕病原物的载体之一，因此，蚕沙的无害化、肥料化处理无论是对蚕业生产副产物的高效、合理利用，还是对阻断家蚕病原物的传播途径，都具有重要的意义。

据报道，锐钛矿型纳米二氧化钛表现出强的光活性，其抗菌、抗紫外线等功能突出，已广泛应用于各个领域[3]。近年来，将纳米二氧化钛作为添食剂应用于养蚕生产的研究在国内外取得了一定进展。已有研究表明，以5 mg/L纳米二氧化钛作为添加剂喷洒在桑叶上饲喂家蚕，有利于家蚕生长发育，不仅可提高饲料效率以及全茧量和茧层量[4-5]，还能促进家蚕生殖发育[6]、丝蛋白合成[7]以及脂肪和碳水化合物的合成与代谢[8-9]。此外，添食纳米二氧化钛还能在一定程度上增强家蚕对核型多角体病毒(BmNPV)和黑胸败血菌(BmBb)的抵抗性[10-12]，能缓解辛硫磷农药对家蚕神经系统[13]、丝腺[14-15]、中肠及脂肪体的损伤[16-17]，提高家蚕幼虫微量农药中毒后的存活率以及蚕茧产量和质量。随着研究的深入，程岚[18]采用ICP-MS法测定了纳米Cu、Ag金属粒子能否被家蚕吸收及其进入蚕体后的代谢途径，结果表明这2种纳米金属粒子都能够通过食物被家蚕吸收，在家蚕的血淋巴、表皮、前部丝腺、中部丝腺以及后部丝腺中均有分布，但大部分的纳米粒子则是通过蚕沙排到了体外。虽然家蚕添食纳米二氧化钛的益处已有较多的研究报道，但蚕沙中含有的纳米二氧化钛对蚕沙肥料发酵过程中细菌群落结构的影响尚不清楚。因此，本研究用5 mg/L纳米二氧化钛处理蚕沙后，采用Illumina Miseq技术对其进行细菌16S rRNA V3-V4区域测序，分析纳米二氧化钛处理对蚕沙细菌群落影响，为制备含纳米二氧化钛的蚕沙有机肥，拓展纳米二氧化钛在蚕业生产中的应用提供参考信息。

1 材料与方法

1.1 材料

供试家蚕品种为两广二号，由广西壮族自治区蚕业科学研究院馈赠。供试纳米二氧化钛为锐钛矿型，购自杭州万景公司，平均粒径为6～10 nm。将供试的纳米二氧化钛配置成5 mg/L悬浊液。

1.2 蚕沙处理方法

饲养家蚕收获5龄蚕的蚕沙，等量分成对照组和处理组，每组6 kg，各设3个平行重复组。处理组蚕沙添加5 mg/L纳米二氧化钛500 mL并搅拌均匀，对照组以等量无菌水代替。在相同环境条件下放置24 h后，在对照组和处理组中分别随机选取5个点采集蚕沙样品，将采集的蚕沙充分混匀成1个样品，各取3次重复。后续对蚕沙样本的细菌16S rRNA V3-V4区域测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3 数据处理

经Illumina MiseqTM/HiseqTM得到各样本有效数据后，进行操作分类单元(OTU)聚类，以相似性>97%的非重复序列为标准，去除嵌合体后得到OTU代表序列，再将所有优化序列与OTU代表序列比对，选取相似性97%以上的序列进行物种注释及统计、物种分布、相对丰度、功能注释和BugBase分析。

2 结果与分析

2.1 蚕沙菌群测序的序列数目和OTU聚类

按照97%相似性对非重复序列 (不含单序列) 进行OTU聚类，对照组和处理组蚕沙测序分别获得62个和61个OTU，覆盖度均达到99%(表1)，其中对照组和处理组共有的OTU数为50个，对照组和处理组特有的OTU数分别为12个和11个(图1)。去除Read引物接头，对照组和处理组样品分别平均获得62 648和66 284有效序列。

表1 纳米二氧化钛处理蚕沙中的菌群高通量测序结果

图1 纳米二氧化钛处理组与对照组蚕沙菌群分布韦恩图

2.2 蚕沙菌群的α多样性

α多样性又被称之为生境内的多样性(within-habitat diversity)。蚕沙经纳米二氧化钛处理后，反映样品中含OTU 数目的Chao指数与菌群组成丰富度和均匀度的Ace指数均高于对照组，表明纳米二氧化钛处理增加了菌群的丰度。对照组蚕沙样品反映菌群多样性的Shannon指数高于处理组，Simpson指数则低于处理组(表2)，表明处理组菌群多样性低于对照组。综上所述，纳米二氧化钛处理增加了蚕沙菌群的丰度，但菌群的多样性降低。

表2 纳米二氧化钛处理对蚕沙菌群丰度和多样性的影响

2.3 蚕沙菌群中优势菌的相对丰度

对蚕沙菌群中优势菌的相对丰度进行分析，结果表明：在分类阶元门和纲水平上，对照组和处理组蚕沙中的优势菌门(图2-A)、优势菌纲(图2-B)类别均相同，只是相对丰度不同；在目水平，处理组蚕沙中假单孢杆菌目(Pseudomonadales)消失(图2-C)；在科水平，处理组蚕沙中新增了棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)，而莫拉菌科(Moraxellaceae)则消失(图2-D)；在属水平，处理组蚕沙中葡萄球菌属(Staphylococcus)丰度增加，此外还新增了棒杆菌属(Corynebacterium)，而不动杆菌属(Acinetobacter)消失(图2-E)。可见，纳米二氧化钛处理蚕沙，对其中的不动杆菌属细菌具有抑制作用，而与其具有拮抗作用的葡萄球菌属、棒杆菌属则丰度增加。

A～E图分别为对照组在门、纲、目、科、属水平上的优势菌群差异。

2.4 蚕沙菌群的功能注释

COG功能注释结果表明，处理组蚕沙具有复制、重组和修复[(L)Replication, recombination and repair]功能的细菌增加，具有脂质转运与代谢[(I)Lipid transport and metabolism]、转录[(K)Transcription]、细胞运动[(N)Cell motility]、次级代谢物生物合成、运输和分解代谢[(Q)Secondary metabolites biosynthesis, transport, and catabolism]、细胞内运输、分泌和囊泡运输[(U)Intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport]等功能的细菌减少，具有其余功能的细菌差异不显著(图3-A)。FAPROTAX功能注释结果表明：纳米二氧化钛处理蚕沙引起具有以下功能的菌类减少，包括芳香族化合物降解(aromatic compound degradation)、纤维素水解(cellulolysis)，哺乳动物肠道(mammal gut)、人类肠道(human gut)感染，碳氢化合物降解(hydrocarbon degradation)、脂肪族非甲烷烃降解(aliphatic non methane hydrocarbon degradation)、芳香烃降解(aromatic hydrocarbon degradation)；具有以下功能的菌类则增加，如叶绿体形成(chloroplasts)、氮呼吸(nitrogen respiration)、硝酸盐呼吸(nitrate respiration)、尿解(ureolysis)、甲基营养(methylotrophy)、甲醇氧化(methanol oxidation)；具有发酵功能(fermentation)的菌类无明显差异(图3-B)。可见，纳米二氧化钛处理可使蚕沙中对哺乳动物及人类肠道有害的致病菌减少，而具有光合作用和氮呼吸功能的菌类增加，同时也不会影响蚕沙的发酵功能。

进一步对差异菌进行了BugBase分析，结果表明，纳米二氧化钛处理使蚕沙中的需氧型菌群减少(图4-A)，厌氧型(图4-B)和兼性厌氧型(图4-C)菌群增加；革兰阴性菌减少(图4-D)，革兰阳性菌增加(图4-E)。潜在致病性分析结果表明，对照组蚕沙中存在变形菌(Proteobacteria)等致病菌，而纳米二氧化钛处理后可完全抑制蚕沙中该类菌的存活(图4-F)。

图3 纳米二氧化钛处理组与对照组蚕沙菌群的COG功能 (A)及FAPROTAX功能(B)注释

A—需氧型菌群，B—厌氧型菌群，C—兼性厌氧型菌群，

3 小结

纳米二氧化钛具有抗菌特性，可作为添加剂提高家蚕产丝量，但家蚕食下的纳米二氧化钛大部分是通过蚕沙排出体外的。蚕沙是蚕桑产业中的大宗副产物，发酵成蚕沙有机肥是目前蚕沙最有效的利用方式。本研究结果表明，以纳米二氧化钛处理蚕沙，增加了蚕沙菌群的丰度，但菌群的多样性降低；纳米二氧化钛抑制了蚕沙中的不动杆菌属，而与其具有拮抗作用的葡萄球菌属、棒杆菌属则丰度增加。此外，FAPROTAX功能注释结果表明，纳米二氧化钛处理使蚕沙中对哺乳动物及人类肠道有害的致病菌减少，而使具有光合作用和氮呼吸功能的菌类增加，同时不会影响蚕沙的发酵功能。进一步的BugBase分析表明，纳米二氧化钛可增加蚕沙中厌氧型和兼性厌氧型菌群，对变形菌等致病菌具有良好的抑制作用。