《生物化学实验》综合性教学项目的建设

李吉馥 周游 左伟东

(西南大学蚕桑纺织与生物质科学学院， 重庆 400715)

2018年，时任教育部部长陈宝生在“新时代全国高等学校本科教育工作会议”上的讲话中提出了做好本科教育工作的具体举措，其中明确提出高等教育内涵发展要更深一些，要及时调整专业人才培养方案，建设综合性、问题导向、学科交叉的新型课程群，将学科研究新进展、实践发展新经验、社会需求新变化及时纳入教材，不能再用过时的知识培养明天的毕业生[1]。作为人才培养重要基地的高校，在培养人才时更需注重创新能力的提高，使学生具备较完整的逻辑思维能力，具有更强的依靠自主学习解决问题的能力。作为高校的教师，则应主动探索参与式教学方法，提高课堂互动性，改革传统教学形态，积极推广PBL教学法、翻转课堂等新型教学模式，提升学生的学习主动性[2]。实验教学作为现代大学发展水平的标志，是一流本科课程建设的重要内容。实验教学课程应力求做到理论与实践相结合，重视培养学生的实践能力，深度分析大胆质疑的创新能力，解决复杂问题的综合能力和高级思维[3]。在实验教学中，高校实验教学人员应该不断探索符合时代背景的实验教学内容，积极完善改进教学方式，为当代中国培养更多优秀的高素质人才。

《生物化学》是一门知识点广博丰富，深奥经纬的基础课程，主要研究蛋白质、糖类、脂类、核酸等生物大分子的结构与功能[4]。作为多个专业重要的基础课，《生物化学》在整个课程体系中处于重要地位。由于生物化学学科的概念抽象难懂，为了使学生更容易理解学习内容，感受到学习《生物化学》课程的乐趣，开设《生物化学实验》尤为必要。《生物化学实验》教学常采用验证性实验与综合性实验相结合的授课策略[5]。相对于简单的验证性实验，综合性实验在培养学生主动思考能力、逻辑推导完整性，以及理解教学内容上具有不可替代的优势[6]。目前，西南大学蚕桑纺织与生物质科学学院的《生物化学实验》主要参考传统的生物化学实验项目开展教学，内容以验证性和基础性居多，未涉及蛋白质免疫印迹方法的学习，亦未结合本学院传统优势学科展开特色化教学。从2018级开始，生物技术专业的《生物化学实验》课程学时由先前的40学时增加至48学时，课时量有所增加。因此，我们希望设计构建具有学科特色的综合性实验项目，以符合课程改革的发展方向，能够引起学生对蚕桑专业的兴趣和热爱，建立起学生对蚕桑专业的认同感，同时也通过实验内容的串联让学生更好地理解基础性实验原理，培养学生的综合能力，即理论联系实际的能力，团队合作的动手能力以及严谨细致的科学态度。

1 实验项目设计的内容

蛋白质的检测和鉴定作为一项经典的《生物化学实验》教学项目，在有生物背景的学科专业中广泛开展。蛋白质免疫印迹技术作为在生物学蛋白质表达、分析研究中应用最多的一种实验技术，在专业学习中不可或缺，对学生以后从事生物学研究和相关工作十分重要。现有的该类实验教学项目设计时间往往较早，实验内容和方法较为陈旧，没有根据学科特色进行相应优化，实验方法也没有更新，这对于激发学生的学习兴趣，了解本学科知识十分不利。因此，本教学团队设计了具有蚕桑特色，基于蛋白质免疫印迹技术的综合性实验教学项目——家蚕幼虫与蛹的微管蛋白鉴定。实验项目的设计衔接了课程内蛋白质的定量实验，选择家蚕5龄第3天的幼虫和化蛹48 h的蚕蛹为实验材料，运用3～4次课程串联蛋白质免疫印迹实验，包括蛋白质的定量实验(BCA法)、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳、蛋白质的转印及免疫检测。实验操作的步骤设计为：提取供试家蚕幼虫和蛹的总蛋白质，利用BCA法进行定量，随后利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分别对家蚕幼虫总蛋白质和蚕蛹总蛋白质进行分离，将凝胶分离的蛋白质进行湿法转膜后，采用免疫印迹方法(Western blot)将微管蛋白抗体与分离后的总蛋白质进行孵育，从而检测并比较家蚕幼虫和蛹的微管蛋白质含量(图1)。

图1 实验教学内容的设计示意图

另外，本科教学与科学研究的实验操作有所不同，本科教学由于人数较多，需综合考虑教室容量、实验室仪器设备台件数等的情况下进行设置，在实验操作中还应考虑如何高效又安全地完成实验教学。为此，本课题组设计的实验教学项目针对30人左右的本科实验教学班进行优化，灵活选用操作流程和方法，使实验方法同时具有特异性好和灵敏度高的双重特点，能够帮助学生完整地理解实验设计原理及思路，有利于启发学生的科研思维和增强实验操作能力。

2 实验材料与方法

2.1 实验材料

家蚕品系大造的5龄第3天幼虫、化蛹48 h的蚕蛹，由本学院研究室提供。

2.2 主要试剂

RIPA裂解液、BCA蛋白测定试剂盒、考马斯亮蓝快速染色液，一抗(Tubulin抗体：小鼠单抗)、二抗[辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)]，DAB显影液等均购自上海碧云天生物技术有限公司。

2.3 实验操作步骤

2.3.1 总蛋白质的制备及定量

存在问题及改进措施如下所述。常规实验中常采用液氮对组织样品进行研磨后再提取蛋白质，但在本科教学中，学生对实验操作不熟悉，且在常压下液氮温度为-196 ℃，容易被冻伤，故对实验操作要求较高。针对未接触过任何专业实验课学习的学生，此方法存在安全隐患。因此，我们选择在该步骤使用玻璃研磨棒在离心管内对样品进行研磨，既能保持课堂秩序，又不存在安全隐患。

实验操作步骤如下。分别称量蚕蛹及幼虫整头样品200 mg，置于无菌离心管中，用玻璃研磨棒研磨至粉末；加入2 mL含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，涡旋振荡后于冰上裂解15 min，最后高速离心取出上清，所得样品则即为家蚕幼虫和蛹的总蛋白质提取物，利用BCA法对其进行定量；随后向60 μg蛋白质样品中加入适量 SDS上样缓冲溶液，于沸水浴中加热后离心，样品可保存于-20 ℃冰箱备用。

2.3.2 总蛋白质样品的SDS-PAGE分析

存在问题及改进措施如下所述。实验室原有设备为1个制胶器对应2块凝胶(图2左)，课题组考虑到在实际教学过程中，2个学习小组共同使用一个制胶架在操作时会有冲突，并且4人共同操作一套设备较为拥挤，易导致学生对实验操作失去兴趣，影响实验教学。因此，经过仔细的市场调研，我们找到一种独立的制胶器，即一块玻璃板对应一个制胶器(图2右)，使用这种独立制胶器能实现学生分组独立操作，减少相互影响，显著提高教学质量。

图2 实验教学制胶器更新前后对比

此外，课题组在SDS-PAGE实验部分设计了凝胶显色实验，方便学生观察到总蛋白质经过SDS-PAGE分离后的变化，因而可以更直观地理解聚丙烯酰胺凝胶对蛋白质的分离作用。在此环节中，常规做法是采购相关的试剂，由教师自行配制考马斯亮蓝染色液及洗脱液。但以上2种溶液的组分中含有大量冰醋酸及乙醇，挥发性强且气味很重，往往导致学生操作时产生畏惧心理，且该种试剂常规染色在室温下需要1 h或更长时间，脱色则需要4～24 h，实验整体时间太长难以适应本科教学。课题组经过市场调研，发现一款无味的考马斯亮蓝快速染色液(碧云天生物技术有限公司，产品编号: P0017)，洗脱时仅需使用蒸馏水即可直观地观察，且染色时间仅需30 min，洗脱时间仅需15～30 min，非常适合本实验项目教学使用。

实验步骤：(1)清洗制胶玻璃板和灌胶架后，使用双蒸水润洗并烘干，玻璃板干燥后，固定在制胶架上并查漏；(2)参照M.R.格林等[7]的方法，配制聚丙烯酰胺体积分数为12%的分离胶；(3)将玻璃板按照规范装入电泳槽中，倒入电极缓冲液至电泳槽内腔至没过上样孔，确保电泳液未漏出后拔出梳子，将蛋白质样品按照设计顺序加入到胶孔内，在实验记录本上做好记录；(4)连接电泳仪，电泳仪设置恒定电压为80 V，开始电泳，当溴酚蓝指示剂进入分离胶后，设置电压为120 V，继续电泳60 min，当溴酚蓝指示剂到达底部后关闭电泳仪；(5)从电泳槽中取出凝胶，丢弃浓缩胶，将分离胶用快速考马斯亮蓝染色液染色30 min之后弃染色液，并加入蒸馏水进行洗脱，直至胶背景清晰，脱色后的胶可以继续保存在蒸馏水中。

2.3.3 微管蛋白的Western blot检测

存在问题及改进措施如下所述。常用的Western blot显色方法主要有底物化学发光ECL法以及DAB呈色法，化学发光底物法需要使用化学发光成像系统进行检测。科学实验中通常使用底物化学发光ECL法，但化学发光成像系统造价往往较高，购置台件数相当有限，不能同时满足若干学习小组同时进行检测，将大大延长实验课上操作和等待时间，显然不利于本科实验教学。因此，课题组选用DAB呈色法对实验结果进行检测，这样学生能够同时进行实验，并且可凭肉眼实时观察实验现象，便于及时记录与分析比较，在教学中更为有效。

详细的实验操作步骤如下。(1)准备转膜前，将配好的转膜液4 ℃预冷，用预冷好的转膜液浸泡转膜夹和滤纸，随后将裁剪好的PVDF膜放入甲醇中激活20 s，激活后及时浸泡于转膜液中；将未染色的凝胶、滤纸、激活后的PVDF膜、海绵，按照海绵、滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸和海绵的顺序制作成三明治结构，注意PVDF 膜和凝胶间不能存在气泡；制作好后放入转膜槽并加入预冷的转膜液，将转膜槽置于4 ℃环境下，转膜仪设置为恒定电流260 mA，转膜90 min，如果目的蛋白质分子量较大，可适当延长转膜时间，如果目的蛋白质的分子量较小，则应适当减少转膜时间。(2)转膜完成后关闭转膜仪，将PVDF 膜放入洗膜盒中，用洗涤液洗5 min，随后倒掉洗涤液加入快速封闭液，置于摇床室温孵育10 min。(3)封闭后回收封闭液，置于4 ℃冰箱中保存。向洗膜盒中加入漂洗液置于摇床上漂洗PVDF膜3次，每次10 min，后加入tubulin一抗的稀释液(1∶10 000)，置于摇床上4 ℃孵育过夜；第2天，回收一抗稀释液置于4 ℃保存，加入漂洗液置于摇床上漂洗PVDF膜3次，每次10 min；加入羊抗鼠二抗稀释液液(1∶10 000)，置于摇床上孵育2 h，回收二抗稀释液置于4 ℃保存，向洗膜盒中加入漂洗液置于摇床上漂洗3次，每次10 min。(4)洗涤完毕后，除去洗涤液，向PVDF膜加入适量DAB染色工作液(DAB显色液A与DAB显色液B的体积比为1∶1)，确保能充分覆盖样品。(5)室温避光孵育3～5 min，观察显色至预期深浅。(6)去除DAB染色工作液，用蒸馏水洗涤1～2次终止显色反应，拍照记录实验结果。

3 实验结果及教学实践

3.1 实验结果

总蛋白质制备得到了2管蛋白质提取液，其中家蚕幼虫的蛋白质提取液呈现浅褐色，家蚕蛹蛋白质提取液呈现深褐色(图3-A)。利用BCA法进行蛋白质定量(图3-B)，家蚕幼虫、蛹蛋白质样品的D(562 nm)值依次为1.087、0.978，通过计算可知家蚕幼虫、蛹的蛋白质质量浓度分别为0.95 μg/μL、0.83 μg/μL。

接着利用SDS-PAGE电泳对总蛋白质进行分离，可以看出家蚕幼虫、蛹总蛋白质提取物中均含有大量分子量大小不同的蛋白质，位于55～72 kD的蛋白质电泳带有数条(图3-C)，在图谱中颜色最深的条带为位于26～34 kD的30 K蛋白。30 K小分子脂蛋白是家蚕5龄幼虫血液中含量最多的一类蛋白质，由脂肪体合成后释放，是卵黄蛋白的主要成分之一，其可以分出15个以上种类的蛋白质。此时我们只分离得到相同分子量大小的蛋白质，还未能鉴定出微管蛋白。利用湿转法将蛋白质从凝胶转移到PVDF膜上后，可以看到预染蛋白质标准品被成功转移到膜上(图3-D)。最后通过免疫印迹实验及显色反应，可以清晰地看到55 kD左右处有明显的条带(图3-E)，此结果即可判定为家蚕5龄幼虫和蛹中均存在的微管蛋白，且含量基本一致。以上结果表明实验成功，本课题组设计的实验教学项目切实可行，可以应用于实验教学。

A. 幼虫与蛹总蛋白质提取液 B. BCA法测定蛋白质浓度的标准曲线 C. 总蛋白质的SDS-PAGE分析 D. 总蛋白质转膜结果 E. 微管蛋白的免疫印迹分析 C～E. M—蛋白质标准品， 1—蛹总蛋白质(60 μg)， 2—幼虫总蛋白质(60 μg)

3.2 教学实践

3.2.1 教学对象

参与本次实验教学的对象为西南大学蚕桑纺织与生物质科学学院2020级生物技术专业“明珠”创新班、1班、2班的76名学生。

3.2.2 实验课程开展方式

授课模式依照先讲原理再操作，最后做总结的时间进度，针对实验课程原理及实验操作环节单独设置预习试题，内容涵盖实验原理的理解、实验材料准备和试剂配置、仪器设备操作、实验流程、操作注意事项等，要求学生课前查阅资料，分组讨论，独立完成试题并撰写预习报告，使学生充分理解实验原理，了解常见仪器设备的功能及使用要点。再结合课堂实验操作，积极观察每组成员实验操作的准确性、流畅性等实验教学质量关键因素，最后依据各小组实验结果进行实验操作及内容的回顾总结，进一步激发学生的求知欲，主动学习生物化学专业知识和蚕桑专业知识。

本实验教学项目的预习试题如下。(1)什么是看家基因？真核生物中有哪些看家基因？(2)聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离原理及凝胶各个组分的作用是什么？(3)聚丙烯酰胺凝胶的胶浓度如何选择？(4)实验时你发现你的凝胶没有凝固，请简述可能的原因，你可以做什么来促使其凝固？(5)操作时，如果你将电泳槽外室中的缓冲液填充到大板的高度以上会发生什么，如果内室中的缓冲液下降到小板的高度以下又会发生什么？(6)电泳时为了节省时间，能否将电压提高到400 V来加快电泳的速度，电压设置范围是多少？(7)转膜时膜和胶应该如何放置，如果放反了会怎么样？

4 讨论

4.1 教学效果评价

实验报告能够全面反映学生掌握实验技能的情况。实验报告的规范性、完整性以及学生的实验收获能够展示实验项目教学的效果。通过预习报告可以看出大部分学生能够清晰理解本实验项目的原理，并表示对课堂操作充满期待。通过本实验教学项目的实验总结报告发现，各班通过本实验项目教学观察到转膜成功的学生为100%，显色平均成功率92%，实验成功率高，相较于其他常规实验教学项目，可以看出学生在报告中对实验思考讨论部分的内容明显增加。另有学生咨询更多实验设计细节以便将该实验方法运用至自己的科研创新项目中，大部分学生表示学习了该实验项目所涉及的实验方法后，能进一步体会到科学研究的奇妙以及严谨性，也能更好地理解学习专业相关科研论文，总之对本实验项目的反响较好。

教学实践证明运用优化后的实验教学方法，学生能够以较高质量完成实验，得到较好的实验结果，从而建立起实验的自信心。

4.2 实验教学过程中的注意事项

该实验项目的操作过程较为繁琐，因此本课题组对实验项目在教学过程中需反复强调的注意事项进行了总结。(1)实验操作时，应全程佩戴好口罩和手套，做好防护。(2)制备凝胶前，制胶器检漏一定要静置足够时间，确认不会漏液再准备制胶，在制备凝胶时一定要将各组分充分混匀。(3)凝胶过程中需把制胶器放在安全的地方，避免碰触。(4)拔梳子时注意缓慢均匀用力，以免上样孔扭曲。(5)制备样品时，上样缓冲液的移取一定要慢，因为其较粘稠，不易吸取。(6)蛋白质裂解后，一定要保持样品在冰上，以免降解。(7)使用电泳仪一定要注意安全，操作前一定要关闭电源，避免触电。(8)转膜操作避免气泡存在，胶与PVDF膜应保持紧密接触。

5 结语

西南大学蚕桑纺织与生物质科学学院在家蚕遗传与种质资源研究等方面成果丰硕，设计开发的融入蚕桑特色的综合性实验项目符合时代需求，选取家蚕的幼虫和蛹作为实验材料，将生命科学研究常用实验方法中的蛋白质免疫印迹引入实验课程教学中，能更好地帮助学生建立学科自信心，在学习经典理论知识的同时，又能强化认知，符合现代教育发展趋势。在该实验项目的教学实践中，预习报告及试题的设置激发了学生的学习主动性，培养了学生的独立思考能力，实验课程过程性考核有效评价了学生的动手能力，多样化的课后思考题增强了学生的创新创业能力。综上所述，本课题组开发设计的具有蚕桑特色的综合性实验教学项目，通过实验验证了其应用于本科教学的可行性，随后联合教学方法改革，最终在本科教学实践中获得了较好的教学效果，提升了教学质量。今后，将通过开发更多适用于本科教学的实验项目，改革教学方法，为蚕桑专业同类院校的生化实验课提供符合新时代人才培养的实验教学项目模板，为全国各学科的专业实验课改革提供参考。