口腔鳞状细胞癌中NCAPD2的表达水平及生物学功能

马 萍，程璐瑶，金武龙，王 宁，翟荣萍

口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)恶性程度高，侵袭性强，是头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC)发生率较高的肿瘤。OSCC是口腔癌最常见的病理类型，约占口腔癌的90%[1]，其五年生存率较低[2]，晚期OSCC化疗极易产生耐药，且化疗效果差[3-4]。因此，寻找新的分子靶标对于OSCC的早期诊断和治疗具有重要的意义。非SMC凝集素Ⅰ复合亚基D2(non-SMC condensin Ⅰ complex subunit D2, NCAPD2)是凝集素Ⅰ的一个组成亚基，位于染色体12p13.3上。凝缩素Ⅰ复合体是由两个“染色体的结构维护”ATPase SMC2/SMC4异源二聚体和三个调节亚基NCAPD2、CAP-G、CAP-H组成[5]。在真核细胞有丝分裂过程中对染色体结构的改变和分离起着不可或缺的作用[6-7]。有研究表明NCAPD2与肿瘤的发生密切相关。在三阴乳腺癌中，NCAPD2与肿瘤细胞的周期、增殖和侵袭相关[8]。NCAPD2与OSCC的关系如何目前尚不清楚。鉴于HNSCC中一半以上病例是OSCC，因此本研究首先通过数据库分析NCAPD2在HNSCC中的表达及与临床病理特征的关系。我们发现NCAPD2在HNSCC组织中表达较高，这提示NCAPD2可能与OSCC的发生发展相关，考虑为OSCC的一个分子治疗靶点。因此，本研究旨在使用免疫组织化学的方法探讨NCAPD2在OSCC中的表达情况，同时在OSCC细胞中探究NCAPD2的生物学功能。

1 材料与方法

1.1 病例选择

本实验所用组织标本取自内蒙古医科大学附属医院口腔颌面外科经手术治疗，并且术后经过病理学诊断确诊的35例OSCC患者，为2018年1月至2020年12月期间手术患者。同时对应收集距肿瘤边缘≥2.0 cm的癌旁正常口腔黏膜组织作为对照。5例癌旁正常组织和35例OSCC组织，其中舌癌4例，颊癌13例，腭癌8例，牙龈癌6例，唇癌4例。其中男16例，女19例，患者年龄38～87岁，平均年龄65岁。按照口腔癌WHO临床病理分级，Ⅰ～Ⅱ级为26例，Ⅲ～Ⅳ级为9例；按照AJCC口腔癌临床分期，Ⅰ～Ⅱ期27例，Ⅲ～Ⅳ级8例；按照是否发生淋巴结转移，有淋巴结转移为11例，无淋巴结转移24例。

1.2 细胞系

OSCC细胞系CAL-27和Tca8113购自北纳生物。

1.3 主要试剂

NCAPD2抗体购自美国Abcam公司(1∶50，Abcam，英国，ab198019)，免疫组织化学试剂盒购自DAKO公司(货号：Denmark, K8000)，磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline，PBS)、柠檬酸缓冲液、苏木精染剂和二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色剂均购自上海齐一生物有限公司，DMEM培养液和胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)均购自美国Gibco公司。

1.4 生物信息学分析

应用UALCAN数据库(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)分析HNSCC组织和正常头颈组织中NCAPD2的表达及其与临床病理特征的关系。

1.5 免疫组化染色

将组织切片脱蜡、修复、柠檬酸封闭，并与NCAPD2 抗体在4 ℃下孵育过夜。用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤5次后，加入通用二抗 IgG，样品在25 ℃下孵育30 min。随后用3,3′-二氨基联苯胺和苏木精对组织切片进行染色以进行可视化。 使用显微镜(奥林巴斯，日本)获取图像。结果判读：NCAPD2的表达以细胞核和细胞质内出现棕黄色颗粒为组织化学染色阳性反应。根据染色强度的评分标准：阴性无着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，深褐色为3分。根据阳性细胞数所占比例的评分标准：0%～25%(包含0%，不包含25%)为1分，25%～50%(包含25%，不包含50%)为2分，50%～75%(包含50%，不包含75%)为3分，≥75%为4分。结果判读：阳性细胞评分×染色颜色强度评分判断IHC结果，分值越高抗体表达越高。0 分为(-)，1～4分为(+)，5～8分为(++)， 9～12分为(+++)。其中(+)和(++)为低表达，(++)和(+++)为高表达。

1.6 质粒构建、细胞培养和慢病毒感染

以NCAPD2基因为模板设计了NCAPD2 特异性靶序列shNCAPD2(5′-CAGGTTCTCAGTGGCGATCAA-3′)和一个阴性对照序列shCtrl (5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′)并整合到 BR-V108载体(上海生物科学有限公司)。使用 EndoFree Maxi Plasmid Kit (Tiangen, DP118)扩增和提取质粒。用3种质粒(BRV-108、PMD2.G 和 pSPAX2)共转染293T细胞以获得慢病毒。CAL-27和Tca8113细胞中加入10% DMEM的完全培养基置于37 ℃、5% CO2的培养箱中进行培养，细胞贴壁后，用含Opti-MEM和 Polybrene的慢病毒载体感染细胞12 ～ 16 h，然后更换新鲜的培养基。72 h后用荧光显微镜观察感染效率。通过qPCR和蛋白印迹法验证NCAPD2敲低效率。

1.7 细胞增殖实验

通过Celigo全视野细胞成像分析仪对细胞实现拍照和自动计数，从而大通量地检测基因对细胞增殖的影响。Celigo是基于全自动图像采集与图像数据分析的高通量筛选系统。通过慢病毒感染细胞，使目标细胞表达GFP(绿色荧光)，在HCS增殖检测实验中，检测目标即为感染病毒后表达GFP的目标细胞(96孔板)。Celigo能识别带绿色荧光的细胞并拍照即读板。然后通过软件对拍照的图像进行分析处理，计算孔板中不同组别含有的细胞数目。连续读板5 d后，即可绘制出细胞生长曲线图，从而反映出细胞增殖状况。增殖率=((每组细胞各时间点细胞计数值-该组第一天的细胞计数值)/该组第一天的细胞计数值)×100%。抑制率=((实验组细胞各时间点细胞计数值-实验组第一天的细胞计数值)/(对照组细胞各时间点细胞计数值-对照组第一天的细胞计数值))×100%。

1.8 细胞凋亡实验

将实验组(感染慢病毒shNCAPD2组)和对照组(感染慢病毒shCtrl组)细胞分别进行慢病毒感染，通过胰酶消化，进行离心和洗涤后弃上清，将binding buffer加入细胞沉淀中收集细胞，使用Annexin V-APC进行染色，24 h内进行流式细胞仪检测，按照凋亡检测试盒说明书及流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.9 蛋白质印迹法(Western Blot)

用RIPA裂解液裂解细胞后提取总蛋白，用BCA试剂盒测蛋白浓度。配制SDS-PAGE胶后进行蛋白电泳，转膜，脱脂奶粉封闭2 h，加一抗4 ℃孵育过夜。洗膜后加二抗室温下孵育1 h，之后进行显色反应，使用电化学发光(electrochemical luminescence，ECL)曝光液曝光。

1.10 实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)

使用Trizol试剂提取RNA，然后用Hiscript QRT Supermix for qPCR (+gDNA wiper)(Vazyme，南京)试剂盒获得cDNA，最后使用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix (Vazyme, Q111-02)试剂盒进行RT-qPCR。引物序列为NCAPD2：正向5′-TCCATCAAACATCTTCCACCAC-3′；反向5′-TGAGGCCAGGATCTATACTTCG-3′。GAPDH:正向5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′；反向5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。GAPDH作为内参，用2-ΔΔCT法计算相对表达量。

1.11 统计学分析

使用SPSS 21.0软件进行统计分析和GraphPad Prism 8进行绘图。数据分析采用平均值±标准差表示，配对比较采用Student′st检验进行统计学分析。采用Mann-WhitneyU分析和Spearman相关性分析NCAPD2表达与OSCC病理分级的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 数据库分析NCAPD2在HNSCC中的表达

应用UALCAN数据库分析发现NCAPD2 mRNA在520例HNSCC组织中表达水平显著高于44例正常头颈组织(P<0.001，图1A)。进一步通过Ualcan数据库分析NCAPD2 mRNA的表达水平与临床病理特征的关系，发现其与HNSCC临床分期、病理分级和淋巴结转移密切相关。在不同临床分期及不同病理分级的HNSCC组织中NCAPD2的表达水平显著高于癌旁正常组织(P<0.001，图1B～1C)；且HNSCC中无淋巴结转移和有淋巴结转移组织中NCAPD2 mRNA的表达水平均高于癌旁正常组织(P<0.001，图1D)。

A:HNSCC中NCAPD2的表达；B:不同临床分期的HNSCC组织中NCAPD2的表达；C:不同病理分级的HNSCC组织中NCAPD2的表达；D:HNSCC中无淋巴结转移和有淋巴结转移组织中NCAPD2的表达

2.2 NCAPD2蛋白在临床OSCC病例组织中的表达

为了验证NCAPD2在OSCC组织中的表达情况，我们使用免疫组化染色的方法验证了NCAPD2蛋白在OSCC组织及正常组织的表达情况，结果显示NCAPD2在细胞核和细胞质中均有表达，主要在细胞质中表达，NCAPD2在OSCC组织中的低表达占比为45.7%(16/35)，高表达为54.3%(19/35)。与癌旁正常组织相比，NCAPD2蛋白表达水平在OSCC组织中明显升高，有统计学差异(P<0.05，图2，表1)。

表1 NCAPD2在OSCC和对照组织中的表达

A:癌旁组织中NCAPD2蛋白的表达 (-);B:OSCC组织NCAPD2弱阳性(+);C:OSCC组织NCAPD2阳性染色(++);D:OSCC组织NCAPD2强阳性(+++)。标尺：100 μm

2.3 NCAPD2蛋白的表达水平与OSCC患者临床病理学特征的关系

为进一步分析NCAPD2蛋白表达水平与OSCC患者临床病理学特征的关系，通过Mann-WhitneyU

分析和Spearman相关性分析，发现NCAPD2蛋白的表达与OSCC的病理分级显著相关，但与患者的年龄、性别、肿瘤大小、淋巴结转移等情况均无关(P>0.05，表2)。提示NAPD2蛋白可能参与OSCC发生、发展的过程。

表2 NCAPD2表达与OSCC患者临床病理学特征的关系

2.4 NCAPD2基因敲减细胞模型的构建

在Tca8113和CAL-27细胞株中，通过转染shNCAPD2构建NCAPD2敲减细胞模型，阴性对照为转染shCtrl。通过观察固定在慢病毒载体上的绿色荧光蛋白(GFP)证实两株细胞的转染效率均>80%(图3A)。qPCR结果表明，NCAPD2在Tca8113和CAL-27细胞中的表达分别下降77.41%和61.94%(P<0.001，图3B)。Western Blot结果显示，NCAPD2敲减细胞模型成功建立(图3C)。

A:通过观察荧光评估 Tca8113和CAL-27 细胞的转染效率, 放大200倍，标尺：100 μm； B:qPCR 检测Tca8113和CAL-27 细胞中NCAPD2的敲低效率; C:蛋白质印迹证实 NCAPD2在Tca8113和CAL-27细胞中的敲除情况；*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001

2.5 NCAPD2基因表达变化对CAL-27和 Tca-8113 细胞增殖的影响

通过HCS探究NCAPD2敲减后对OSCC细胞系CAL-27和Tca8113增殖能力的影响。结果表明，相比对照shCtrl组，NCAPD2敲减的shNCAPD2组细胞增殖能力明显下降。此外，与对照组shCtrl相比，NCAPD2敲减后细胞的生长受到明显抑制，Tca8113和CAL-27细胞的增殖抑制率分别为45.3%和53.2%，差异有统计学意义(P<0.05，图4A、B)。

2.6 NCAPD2基因表达变化对口腔癌CAL-27和Tca-8113 细胞凋亡的影响

通过流式细胞仪检测NCAPD2敲减后对细胞凋亡的影响。结果表明，NCAPD2的敲减促进了OSCC细胞Tca8113和CAL-27的凋亡，凋亡率分别为5.04%(倍数变化=5)和1.91%(倍数变化=1.9)，差异有统计学意义(P<0.05，图4C、D)。

2.7 Tca8113细胞中凋亡相关蛋白的检测

从Western Blot结果可以看出，相比于对照组，NCAPD2敲减后，Tca8113细胞中促凋亡蛋白Bax和p53表达上调，而抗凋亡蛋白Bcl-2和p21表达水平下调，差异有统计学意义(P<0.05，图4E)。

A:NCAPD2敲减后对Tca8113细胞增殖能力的影响；B:NCAPD2敲减后对CAL-27细胞增殖能力的影响；C:NCAPD2敲减后对Tca8113细胞凋亡的影响；D:NCAPD2敲减后对CAL-27细胞凋亡的影响；E:Tca8113细胞中凋亡相关蛋白的检测。与对照组相比，*:P<0.05，**:P<0.01，***:P<0.001

3 讨 论

口腔鳞状细胞癌(OSCC)是口腔癌最常见的亚型，约占口腔癌的90%，它是一种易复发和转移的恶性肿瘤[9]，且治疗效果不佳，五年生存率仅有50%[10]。因此， 迫切需要探索OSCC的分子基础并制定有效的治疗策略， 从而最终提高OSCC患者的生存率。

凝集素在有丝分裂染色体凝聚过程中起着重要作用[11]。在真核细胞中有两种不同类型的凝集素复合物，分别称为凝集素Ⅰ复合物和凝集素Ⅱ复合物。经典凝集素复合物共享同一对核心亚基，称为染色体结构维持蛋白(structural maintenance of chromosome proteins，SMC)和3个不同的非SMC亚基[12]。在人类细胞中，凝集素Ⅰ的非SMC亚基是NCAPD2、NCAPG和NCAPH，而凝聚素Ⅱ复合物中的相应对应物是NCAPD3、NCAPG2和NCAPH2[13]。NCAPD2是位于染色体12p13.3上的凝集蛋白Ⅰ中的三个非SMC亚基之一。NCAPD2在真核细胞有丝分裂过程中对染色体结构的改变和分离起着不可或缺的作用[6-7]。转染研究和定点诱变证实非SMC亚基NCAPD2是E2F的靶标[14]。NCAPD2具有HEAT重复序列，介导蛋白质-蛋白质相互作用[15]。NCAPD2通过其羧基末端的双核核定位信号介导凝集素复合体在染色质上的募集和靶向定位[16]，主要参与细胞周期过程中染色体的凝集和分离。

20多年的研究，NCAPD2的基本生物学功能已被阐明。其与人类疾病关系的研究处于起步阶段。据报道NCAPD2与神经系统变性疾病有关。NCAPD2基因多态性与晚发性阿尔茨海默病[17-18]和汉族人群帕金森病有关[19]。Zhang等[8]报道了NCAPD2与乳腺癌之间具有密切关系。NCAPD2在三阴乳腺癌细胞中参与了包括细胞周期、细胞增殖、细胞分裂和侵袭等多种与肿瘤恶性表型密切相关的生物学功能。除此之外，也有研究表明卵巢癌中 NCAPD2的异常表达可能是一个独立的预后因素[20]。最近有研究表明NCAPD2在结直肠癌临床组织和肿瘤细胞中高表达，并在促进结直肠癌发生和生长中发挥作用[21]。

本研究结果表明NCAPD2在OSCC中表达上调，并参与OSCC细胞的增殖、凋亡等过程。IHC染色显示NCAPD2在细胞核和细胞质中均有表达，主要在细胞质中表达，这与Schmiesing等的研究结果相符，即在间期至分裂前期大部分NCAPD2与SMC4-SMC2复合物从染色体解离分布在细胞质中，少部分复合物保留在染色体上[22]。此外，免疫组化结果表明与癌旁正常组织相比，NCAPD2蛋白表达水平在OSCC组织中明显升高，这与Jing等的研究结果一致，即在结肠癌中NCAPD2的表达水平较癌旁组织升高[21]。

之后，我们使用慢病毒感染构建了NCAPD2低表达的OSCC细胞模型进行验证。发现与对照组相比，NCAPD2敲减组细胞增殖能力明显下降。Tca8113和CAL-27细胞的增殖抑制率分别为45.3%和53.2%，与此同时，Tca8113细胞的凋亡率为5.04%，而CAL-27细胞的凋亡率为1.91%，两组细胞的增殖与凋亡结果相反。在Tca8113细胞中进行的凋亡相关蛋白的检测结果表明相比于对照组，NCAPD2敲减后，Tca8113细胞中促凋亡蛋白Bax和p53表达增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2和p21表达水平降低，凋亡相关蛋白表达检测结果与细胞的表型实验结果相一致。本研究表明NCAPD2在负性调控促凋亡蛋白Bax和p53表达的同时，可正向调控抗凋亡蛋白Bcl-2和p21的表达，从而通过抑制Tca8113和CAL-27细胞的凋亡而发挥促癌作用。

综上所述，NCAPD2在OSCC中高表达，且与病理分级和临床分期相关，同时，NCAPD2能够促进OSCC细胞的增殖，抑制其凋亡，可能与其抑制凋亡相关蛋白的表达有关。这些结果表明NCAPD2可能与OSCC的发生发展有关，有望成为OSCC治疗的潜在靶点。

尽管我们的研究发现NCAPD2在OSCC发生发展中发挥着重要作用，并与OSCC细胞的增殖和凋亡相关，是一种潜在的OSCC预后标志物。但是具体分子机制如何，我们需要进行进一步研究。