CLDN1与P16、Ki67在宫颈上皮内病变组织中的表达比较及意义

王琳，陈九伟，吕秀萍

1.淄博市妇幼保健院妇科，山东淄博 255000；2.潍坊医学院附属医院妇科，山东潍坊 261000

子宫颈癌位居全球女性常见癌症的第4位，在发展中国家目前仍是女性癌症死亡的主要原因[1]，子宫颈癌最常见的病理类型是鳞状细胞癌，其癌前病变子宫颈鳞状上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia,CIN)对应的组织病理学分为1～3级，CIN1大多可自然消退CIN2/3发展为子宫颈癌的风险较高，所以及时发现并积极治疗CIN2/3是预防子宫颈癌的重要措施。受多种因素影响CIN的分级诊断一致性差，目前P16与Ki67作为重要标记物被广泛应用于CIN的病理分级诊断。CLDN1是细胞紧密连接家族蛋白成员之一，有研究通过免疫组化实验发现，CLDN1在正常宫颈组织、CIN、子宫颈浸润癌中的表达逐渐增加，因此认为CLDN1对宫颈鳞状上皮细胞的癌变具有促进作用[2]。本研究选取淄博市妇幼保健院在2016年1月—2017年12月62例CIN1～3级标本，通过免疫组化染色技术监测CLDN1、P16、Ki67在不同级别CIN中的表达状态，探讨3种生物标记物与病变级别的关系，一方面进一步验证P16、Ki67在CIN病理分级诊断中的价值和作用，另一方面观察CLDN1是否可以作为一种新的标记物，应用在CIN分级诊断中，提高CIN诊断的准确性和可重复性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取经病理诊断为CIN的宫颈组织石蜡包埋标本62例，患者年龄22～64岁，平均（44.50±10.13）岁。所选患者的组织学切片全部由高年资的病理医师复查确认，包括CIN1级22例，CIN2级18例，CIN3级22例，诊断标准参照2003版WHO子宫颈肿瘤组织学分类标准。本研究已获本院伦理委员会同意，所有患者均知情并自愿参加。

1.2 方法

免疫组化采用SP法，操作按试剂说明书进行（主要试剂及试剂盒均购自北京西雅金桥生物技术有限公司）。该实验用PBS替代一抗作为阴性对照，用已知的CIN阳性切片作为阳性对照。

1.3 结果评定标准

阳性染色定位：P16定位于细胞核或胞核加胞质，Ki67定位于细胞核，CLDN1定位于细胞膜和细胞质中。染色结果判读是采用强度和分布的半定量报告，其中染色强度分为：淡黄色（弱阳+），黄色（阳性++），棕黄色（强阳+++）。分布则根据阳性细胞实际所占比例计算其百分数：在高倍镜下随机选取10个不重复的视野，每个视野内计数10个细胞，计算平均值作为阳性细胞的百分数。P16阳性细胞数＜5%为阴性（-），5%～25%为（弱阳+），26%～75%为（阳性++），＞75%为（强阳+++），P16仅有胞质着色及仅有小簇细胞着色均判为阴性。Ki67阳性表达局限于上皮的基底或基底旁层为阴性（-），超过基底层的10%～25%为（弱阳+），26%～75%为（阳性++），＞75%为（强阳+++）。CLDN1无明显阳性细胞为阴性（-），阳性细胞数目＜25%为（弱阳+），阳性细胞数目25%～50%为（阳性++），阳性细胞数目＞50%为（强阳+++）。

1.4 统计方法

采用SPSS 19.0统计学软件处理数据，CIN 1～CIN3级中的阳性表达率组间差异采用χ2检验分析；P16、Ki67及CLDN1的阳性表达率与CIN级别的相关性采用Spearman等级相关（秩相关）分析；P16、Ki67及CLDN1～3者之间两两比较采用四格表资料的χ2检验分析。计数资料以[n(%)]表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 P16、Ki67和CLDN1在不同级别CIN中的表达比较

P16在CIN1～3级中的阳性率逐渐升高，分别为45.5%、61.1%、100.0%，且在HSIL（CIN2级、CIN3级）中阳性及强阳性所占的百分比明显大于LSIL（CIN1级），差异有统计学意义（χ2=16.209，P＜0.001）。见图1和表1。

图1 P16免疫组化表达

Ki67在CIN1～3级中的阳性率也逐渐升高，分别为50.0%、55.6%、100.0%，同样在HSIL（CIN2～CIN3级）中阳性及强阳性所占的百分比明显大于LSIL（CIN1级），差异有统计学意义（χ2=15.211，P＜0.001）。见图2和表1。

图2 Ki67免疫组化表达

CLDN1在CIN1～3级中的阳性率分别为68.2%、11.1%、36.4%，差异有统计学意义（χ2=13.622，P＜0.001），但实验结果显示CLDN1的阳性表达并不随病变级别的增加而增加，相反CIN1级中CLDN1的阳性率最高，CIN2级中的阳性率最低，CIN3级居中，无规律性可循。见图3和表1。

图3 CLDNI免疫组化表达

2.2 P16、Ki67和CLDN1的阳性表达率与CIN级别的相关性

经Spearman等级相关（秩相关）分析，P16、Ki67二者的阳性表达与宫颈病变级别呈正相关（r1=0.658，r2=0.604，P＜0.001）；CLDN1的阳性表达与宫颈病变级别无明显相关（r=-0.340）。见表1。

表1 P16、Ki67、CLDN1在宫颈CIN1～CIN3中的表达

2.3 P16、Ki67和CLDN1 3者之间的关联性研究

经χ2检验，P16与Ki67的阳性表达具有相关性（χ2=21.514，P＜0.001，r=0.589），见 表2；P16与CLDN1的阳性表达没有相关性（χ2=0.565，P＞0.05，r=-0.095），见表2；Ki67与CLDN1的阳性表达也没有相关性（χ2=0.870，P＞0.05，r=0.118），见表2。

表2 P16、Ki67、CLDN1的关联性研究

3 讨论

子宫颈癌前病变的管理取决于确认CIN分级，但病理医师受切片质量、自身观念、资历等多种因素影响，可能对CIN作出不同判断。2012年起国际上采用LSIL（CIN1）和HSIL（CIN2、CIN3）对子宫颈癌前病变进行诊断，CIN2中可能包含部分CIN1及部分CIN3，若笼统地将CIN2都归入高级别宫颈上皮内病变，可能会导致其范围的扩大。系统回顾CIN2给予保守治疗后[3]，50%逆转，32%持续，18%进展，30岁以下消退率较高（60%）。临床处理时，宫颈锥切术也会带来如宫颈粘连、宫颈管缩短、宫颈组织增生等潜在的危害和风险。此外随着肿瘤的年轻化，保留生育功能成为热点，有文献报道，因高级别病变行宫颈锥切术后再妊娠，发生早产、胎膜早破的危险会升高，早产导致的低出生体重儿的发生率也上升，对于未完成生育的年轻女性，在病理诊断中区分CIN2和CIN3，评估CIN病变进展风险有一定的临床意义[4]。鉴于此，ASCCP共识指南（2019版）建议，因为CIN2、CIN3的进展风险及治疗方式不全相同，所以宫颈病变病理学报告应采用HSIL（CIN2）、HSIL（CIN3）这样的方式报告，在病理诊断中加入CIN2或CIN3这种限定性词语[5]，对于某些情况下的CIN2，可以接受保守治疗。分子标记物有助于可疑病例的协诊以及复发和转移的高风险预测，因此需要使用一些标记物作为CIN辅助诊断的量化指标，以便于准确评估病变，避免过度治疗[6]。

P16是一种细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物，Ki67是一种细胞增殖活性相关抗体，反映细胞增殖活性。Giorgi Rossi[7]的包括40 509例研究对象的横断面研究显示，p16/Ki67具有很好的分流潜能及对CIN2患者HPV清除的预测能力。本研究结果发现，P16阳性表达率为：CIN1组为45.5%，CIN2组61.1%，CIN3组100.0%；Ki67阳 性 表 达 率 为：CIN1组 为50.0%，CIN2组55.6%，CIN3组100.0%；P16、Ki67的阳性表达差异有统计学意义（P＜0.001），且与CIN的严重程度呈正相关(r1=0.658，r2=0.604)。张滨惠等[8]研究指出P16在CIN1组的阳性表达率是3.6%，CIN2、CIN3均是100%；Ki67在CIN1组的阳性表达率是67.9%，CIN2、CIN3也均是100.0%，P16、Ki67的阳性表达与宫颈病变严重程度呈正相关（r=0.873、0.793，P＜0.05），与本研究结论相符。姜洪翠等[9]研究也指出，CIN2、CIN3的P16阳性表达率和Ki67阳性表达率均高于CIN1，P16及Ki-67的表达情况与宫颈病变严重程度存在密切关系。李琪雁等[10]研究则采用二分类法，在LSIL与HSIL中，P16的阳性表达率分别为63.89%、86.84%，Ki67的阳性表达率分别为55.56%、94.4%，随病变加重阳性率逐渐升高。Lewitowicz P等[11]同样认为在LSIL与HSIL两组比 较中，P16、Ki67的阳性表达随病变加重而逐渐升高，提示P16和Ki67可能促进宫颈癌的发生，在LSIL与HSIL的鉴别诊断上具有一定的应用价值。张滨惠等[8]研究还发现CIN病变级别越高，P16、Ki67阳性强度越高，提示P16、Ki67阳性表达情况可以反映CIN病变程度。本研究结果显示，P16、Ki67在CIN2、CIN3中阳性及强阳性所占的百分比明显大于CIN1，与上述文献报道相符。因此，P16、Ki67可以作为高级别CIN的鉴别指标，为CIN的分级诊断、个体化治疗提供准确、客观的依据。

在正常生理情况下，不会出现P16和Ki67的同时表达，二者同时表达则提示细胞周期存在增殖失调，并预测存在宫颈高级别病变[12]。有研究报道，P16联合Ki67诊断CIN1、CIN2、CIN3时，均具有很高的一致性，可以通过P16联合Ki67表达情况，辅助CIN级别严重程度判断[8,13]。李琪雁等[10]研究认为，P16和Ki67阳性表达呈正相关（r=0.599，P＜0.001）。本研究中P16和Ki67的阳性表达具有明显相关性（r=0.589，P＜0.001），与上述报道相符，说明二者具有较高的诊断一致性，因此在病理诊断中联合检测P16、Ki67的免疫组化染色，可以提高宫颈高级别病变诊断的特异度和灵敏度，对CIN诊断具有重要意义。

Claudins是细胞内紧密连接的主要封闭蛋白，Claudins蛋白的异常表达可引起疾病的发生，甚至产生肿瘤[14]。SzabóI等[15]总结了近年来一些关于Claudins与妇科恶性肿瘤的研究，结论显示在妇科恶性肿瘤中Claudins大多数是上调表达的。CLDN1是紧密连接20余个家族成员之一，有研究证明CLDN1在子宫颈癌中高表达，其在宫颈肿瘤的发生发展中具有重要作用[16]，但CLDN1在CIN中的表达研究较少。本研究中CLDN1在各级CIN中的表达虽然有差异，但与病变级别不相关（r=-0.340），不支持将CLDN1作为一种标记物用于CIN的病理分级诊断。此外，Szekerczés Tímea等[17]认为使用p16/Ki67和CLDN1/Ki67双重免疫反应在宫颈癌筛查中的敏感性和特异性是相似的，本研究内容虽不相同，但CLDN1与P16和Ki67的阳性表达均不具有相关性（r=-0.095、0.118，P＞0.05），无法证明在肿瘤评估方面3者之间有协同关系。实验结果的差异一方面不排除在实验过程中与试剂来源、实验操作、实验方法等因素有关，另一方面不排除本研究的样本量较小，且标本来源于同一地区，不能充分说明CLDN1在CIN中的作用机制。

综上所述，P16、Ki67提高了CIN分级诊断的准确性和一致性，防止过度治疗，减少了手术和日后妊娠相关的并发症，在临床中有可用性和可重复性。CLDN1作为一种比较新的生物标记物在CIN进展过程中的作用及病理诊断意义尚不明确，今后还需要更多的研究来探索。