小麦矮腥黑粉菌效应蛋白g11335的生物信息学分析、亚细胞定位及毒性验证

郭志浩 金泽鑫 刘琦 高利

（1. 新疆农业大学农学院 农林有害生物监测与安全防控重点实验室, 乌鲁木齐, 830052；2. 中国农业科学院植物保护研究所 植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193）

由小麦矮腥黑粉菌（Tilletia contraversaKühn，TCK）引致的小麦矮腥黑穗病，是我国的一类检疫性病害，也是一种重要国际检疫性病害［1］。该病害对小麦生产具有破坏性，其发病率约等于小麦减产率，并可使小麦产量减少80%以上，甚至导致小麦颗粒无收。该真菌可以通过种子、土壤、空气等传播并且可以在土壤中生活多年，一旦引入很难根除。目前此病害已在世界范围内传播扩散，并带来极大的损失，在40多个国家被列为检疫性病害，严重威胁着世界农业发展与人类健康［2］。近年来我国每年进口小麦400万t，随着我国加入WTO和“一带一路”政策的实施，小麦的进口风险不断增加。

小麦是我国的三大主粮作物之一，小麦的安全生产和病害防控对确保国家粮食安全有着重大的战略意义［2］。我国的小麦生产中，冬小麦占据绝大多数，而冬小麦是矮腥黑穗病的主要寄主。随着国际贸易及国际交往的日益频繁，TCK给我国带来的风险越来越大，如果TCK没有得到很好的控制，我国作为小麦生产国将会受到其巨大威胁，并对粮食生产和民生造成无法估量的损害［3］。因此，分析该病原菌侵染小麦的机制，对于有效预防和控制该病害具有重要意义。

小麦矮腥黑粉菌效应蛋白g11335为GSDH家族的效应蛋白，该家族的成员为葡萄糖/山梨醇酮脱氢酶。GSDH家族的一些相似家族UGDH家族和CbGDH家族的成员具有对植物体产生影响的报道。雷胤民［4］研究表明了GSDH家族的相似家族UGDH家族的蛋白尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶可以通过多糖代谢调节植物生长发育。杨颖［5］研究发现GSDH家族的相似家族UGDH家族尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶能够将UDP-葡萄糖转化为UDP-葡萄糖醛酸，在毛竹体内的半纤维素合成中起关键作用。陈英［6］证明了GSDH家族的相似家族CbGDH家族葡萄糖脱氢酶很可能与复合酶协同提高了竹笋膳食纤维的理化性质。因此GSDH家族的成员葡萄糖/山梨醇酮脱氢酶是否能对植物体产生影响便成为了值得关注的研究。

本研究利用TCK基因组数据克隆出TCK的效应蛋白基因g11335，对该蛋白生物信息学进行分析，通过构建亚细胞定位载体进行蛋白亚细胞定位分析［7-8］，为小麦矮腥黑粉菌的后续相关研究以及对GSDH家族的后续相关研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株及接种材料 小麦矮腥黑粉菌race-2生理小种菌株，烟草品种为本氏烟。

1.1.2 试剂 大肠杆菌Trans-t2blue感受态购自北京全式金生物技术有限公司。农杆菌GV3101感受态购自上海唯地生物技术有限公司。2×Pro Taq Master Mix酶、2×Phanta Flash Master Mix、50 mg/mL卡那霉素、20 mg/mL利福平购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。质粒提取试剂盒、凝胶纯化回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。

1.1.3 主 要 仪 器 PCR仪，美 国Thermo Fisher Scientific公司生产。超速离心机，德国eppendrof生命科学公司生产。50 mL离心机，德国Sigma公司生产。小型水平电泳仪，美国Bio-rad公司生产。高压灭菌锅，美国Zealway公司生产。GHB-202恒温金属浴，杭州博日科技有限公司生产。大容量全温振荡器，苏州培英实验设备有限公司生产。FastPrep-96高通量快速样品制备仪，美国MP Biomedicals公司生产。

1.2 方法

1.2.1 TCKg11335基因的克隆 收集萌发后各个生长阶段（包括初生担孢子，次生担孢子，H体和侵染菌丝，在土壤培养基中培养获得）的TCK菌丝，利用Tirzol法提取RNA。再利用一步法反转录PCR获得cDNA。根据TCK基因组设计引物数据设计引物g11335-F和g11335-R（表1），以用反转录法获得的TCK的cDNA为模板进行PCR 扩增，反应体系如下：cDNA 模板1 μL，2×Phanta Flash Master Mix 12.5 μL，引物g11335-F 1 μL，引物g11335-R 1 μL，ddH2O 9.5 μL，共 25 μL。扩增程序为：98℃ 30 s；98℃ 10 s，55℃ 5 s，72℃ 10 s，35个 循 环；72℃1 min。验证PCR产物，采用琼脂糖凝胶电泳技术。把目的片段纯化回收，送至北京擎科生物科技有限公司进行测序。

1.2.2 PGR-107载体的线性化 PGR-107载体线性化的酶切体系如下：PGR-107载体质粒5 μL，ClaI酶1 μL，SalI酶1 μL，Loading Buffer 2 μL，用无菌无酶水补至20 μL。将体系溶液37℃酶切3 h后电泳，切胶回收目的片段即可得酶切后的PGR-107质粒溶液。

1.2.3 TCKg11335-PGR107载体的构建 把g11335基因的质粒体连接到酶切后的PGR-107，再转入Trans-t2blue大肠杆菌的感受态细胞；将其中的阳性单菌落送北京擎科生物科技公司进行检测，将测序正确的单菌落摇菌并提取质粒即可得到g11335-PGR107的质粒溶液。PGR107载体的测序引物为PGR107-F和PGR107-R。

1.2.4 农杆菌转化 把测序正确的g11335-PGR107质粒溶液，按照GV3101农杆菌感受态细胞说明书步骤进行热击转化，经接种呈阳性克隆后在LB液体培养基中28℃摇菌扩繁，再次扩繁出大量的农杆菌液。

1.2.5 烟草瞬时表达 将BAX和EGFP的农杆菌液大量扩繁。OD600值调至0.5，随后采用等容积的buffer（10 mmol/L MES，200 μmol/L AS，10 mmol/L MgCl2）溶液进行悬浮，并在室温湿度下静置约3-4 h活化，然后将下表皮细胞采用六区注射法注入长至四周大的烟草叶子背面，在继续培养约4-6 d后观察烟草叶子的显症状况。

1.2.6 生物信息学分析方法 获得g11335的基因序列后，通过NCBI比对获得同名效应蛋白g11335氨基酸序列FASTA格式。运用（https://web.expasy.org/protparam/）即ProtParam软件分析蛋白质理化性质，运 用（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）即TMHMMServerv.2.0软件预测其跨膜区，并使用NCBI中的Conserved Domains软件（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析它的结构域，使 用（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=%20npsa_sopma.html）即SOPMA软 件 来进行蛋白质二级结构分析，用（https://swissmodel.expasy.org/）即Swiss-Model软件进行蛋白质三级结构建模［7］。

1.2.7 效应蛋白g11335的亚细胞定位 首先将pBin载体线性化，酶切体系如下：pBin载体质粒5 μL，KpnI酶1 μL，BamH I酶1 μL，Green Buffer 2 μL，用无菌无酶水补至20 μL。将体系溶液37℃酶切3 h后，采用琼脂糖凝胶电泳技术。将目的片段纯化回收即可获得线性化的pBin载体。

以TCK的cDNA为 模 板，以g11335-YF和g11335-YR（表1）为引物，获得具有pBin的同源臂的产物，反应体系如下：cDNA模板1 μL，2×Phanta Flash Master Mix 12.5 μL，引 物g11335-F 1 μL，引物g11335-R 1 μL，ddH2O 9.5 μL，共 25 μL。扩增程序为：98℃ 30 s；98℃ 10 s，55℃ 5 s，72℃ 10 s，35个循环；72℃ 1 min。验证PCR产物，采用琼脂糖凝胶电泳技术。将目的片段纯化回收，克隆至pBin载体，转入Trans-t2 blue大肠杆菌感受态细胞，在37℃培养箱中培养10-12 h待其长出单菌落。对单菌落进行菌液PCR鉴定，将阳性菌液送至北京擎科生物科技有限公司进行测序。

农杆菌转化和亚细胞定位：将阳性菌液转入10 mL的LB液体培养基扩繁（含有50 mg/mL卡那霉素）中，37℃，220 r/min培养过夜后提取质粒。利用热击转化法按照GV3101农杆菌感受态细胞说明书步骤进行转化，在28℃培养箱中避光培养2-3 d待其长出单菌落。对单菌落进行菌液PCR鉴定，将农杆菌的阳性转化子于5 mL的LB液体培养基（含有50 mg/mL卡那霉素和20 mg/mL利福平）中，28℃，220 r/min培养过夜。取部分培养后的菌液按1∶100的配比，转入10 mL的LB液体培养基中扩繁，28℃，220 r/min培养至OD600=0.8左右，后用等体 积 的buffer（10 mmol/L MES，200 μmol/L AS，10 mmol/L MgCl2）重悬菌体，离心弃上清，重复该步骤3次，再用buffer调至OD600=0.5左右，并在室温下静置3-4 h活化［8］，再由下表皮注射到4周的烟草叶片背面，在2-3 d后，用激光共聚焦显微镜观察烟草中的定位情况［9］。

2 结果

2.1 小麦矮腥黑粉菌基因g11335的克隆

以TCK的cDNA为模板，用引物g11335-F和g11335-R（表1）扩增出约1.4 kb的目的基因片段。将 PCR凝胶产物回收，测序后获得1 389 bp长度的序列，如图1所示。

2.2 效应蛋白g11335的生物信息学分析

2.2.1 效应蛋白g11335的保守结构域分析 基因g11335全长1 389 bp，通过NCBI比对得效应蛋白g11335氨基酸序列FASTA格式：MRVATFLAQASC LLSFATGALAARQLGNLGNVKFTADLWAANITGAR NLVFDAVGDLLVIQTDPNSSTNALDGVAGSGLLFPA VVGLVDFGTIDSPRVKTYPIVQNTSLPQGFIPNHGIEI IDNYLYLSNETSIWRWPYRAGQRRSVSASSAQLFTSN MPWKDDKFFVADGLDLNIDYTDNRSDIRYFPVRSAP IPAGGWDWYSRPIWALGLRNAVGLAIQPVTNWLWE TDQGIDDLYREDLGGDIHNDNPPDELNLLDNWSKPE TVNAQKPYHFGFPYCWTEGNITNASSTVGPHKAGD QWAQYLNRSDYTDAYCKDPKKNIKPLALVQAHAAP LGIQFFNGTGCVNTPNCNSKRNPFTCNYTGQLFFTA HGADNRDRSVGHFFGTFPFSSKTKLPSRPLAAPPAN YDELYGETDQTLCTVSFSGQNCWRPTMIKFDRFGRL FITENNRGEVWRLSIDGTA。

该效应蛋白共编码462个氨基酸，含有典型GSDH结构域，可能是葡萄糖/山梨醇酮脱氢酶家族成员，具有β螺旋折叠，如图2所示。

图2 效应蛋白g11335的保守结构域分析Fig. 2 Conserved domain analysis of effector g11335

2.2.2 效应蛋白g11335理化性质分析 效应蛋白g11335的相对分子质量为51 270.39 Da，理论等电点pI为5.68，说明了蛋白质的偏酸。氨基酸总数则是462个，其 中 Ala（A）39个（8.4%）、Arg（R）24 个（5.2%）、Asn（N）35个（7.6%）、Asp（D）34个（7.4%）、Cys（C）8个（1.7%）、Gln（Q）17个（3.7%）、Glu（E）11 个（2.4%）、Gly（G）37 个（8.0%）、His（H）7 个（1.5%）、Ile（I）22 个（4.8%）、Leu（L）40个（8.7%）、Lys（K）15个（3.2%）、Met（M）3个（0.6%）、Phe（F）26个（5.6%）、Pro（P）30个（6.5%）、Ser（S）29个（6.3%）、Thr（T）32 个（6.9%）、Trp（W）14个（3.%）、Tyr（Y）16个（3.5%）、Val（V）23个（5.0%）。Asp和Glu的总数即负电性残基总数为45个，而Arg和Lys的总量即正电荷残基总数为39个。g11335蛋白的不稳定指数是34.17，属于稳定蛋白。脂肪指数为75.22，而总平均亲水性则为-0.333。预测该蛋白质的半衰期是超过30 h在哺乳动物的网织红细胞中，超过20 h在酵母中，以及超过10 h大肠杆菌感染中。该蛋白的亲疏水性，最疏水性数值是2.533，而最亲水数值则为-2.456。如图3所显示，在g11335效应蛋白中亲水的氨基酸数量更多，是偏亲水蛋白质。

图3 效应蛋白g11335的亲疏水性图Fig. 3 Hydrophilicity of effector g11335

2.2.3 效应蛋白g11335信号肽分析 效应蛋白g11335信号肽分析，信号肽长度为23个氨基酸，信号肽切割位点C的最高值为0.763，位于第23位氨基酸；信号肽分数S的最高值为0.900，位于第3位氨基酸；合并后切割位点的Y最高值约为0.791，位于第23位氨基酸。S平均值为0.819，所预测的切割位点约在1-22位氨基酸之间。如图4所示。

图4 效应蛋白g11335信号肽预测Fig. 4 Signal peptide prediction of effector g11335

2.2.4 效应蛋白g11335跨膜区分析 效应蛋白g11335跨膜区分析，通过对跨膜区的预测发现，在g11335效应蛋白质的全部462个氨基酸中，无跨膜区，如图5所显示。

图5 效应蛋白g11335的跨膜区预测Fig. 5 Prediction of transmembrane region of effector g11335

2.2.5 效应蛋白g11335二级结构预测分析 效应蛋白g11335二级结构分析结果表明，该氨基酸具有α-螺旋、延伸链、β-转角和不规则卷曲。其中，有51个氨基酸形成α-螺旋占11.04%，115个氨基酸形成延伸链，占24.89%；30个氨基酸形成β-转角，占6.49%；266个氨基酸形成不规则卷曲，占57.58%，如图6所显示。

图6 效应蛋白g11335的二级结构预测Fig. 6 Secondary structure of effector g11335

2.2.6 效应蛋白g11335三级结构预测分析 为了解g11335蛋白的三维结构，利用Swiss Model软件对其进行同源建模。以6ilq.1.A蛋白质为模板，6ilq.1.A蛋白质与效应蛋白g11335的同源相似度为31.44%。6ilq.1.A蛋白质为可溶性奎诺蛋白葡萄糖脱氢酶，具有里氏木霉糖活性酶家族AA12的碘化结构。以6ilq.1.A蛋白质为模板预测分析获得效应蛋白g11335三维效果图，如图7所示。

图7 效应蛋白g11335的三级结构预测Fig. 7 Tertiary structure prediction of effector g11335

2.3 效应蛋白g11335亚细胞定位及荧光观察

利用激光共聚焦显微镜进行亚细胞定位观察，发现对照pBin空载体在本氏烟的细胞膜和细胞核都有表达，效应蛋白g11335定位在本氏烟的细胞膜上。说明g11335效应蛋白大部分表达于细胞膜，如图8所示。

图8 效应蛋白g11335亚细胞定位图Fig. 8 Subcellular localization of effector g11335

2.4 效应蛋白g11335烟草毒性验证

烟草毒性验证结果显示，效应蛋白g11335不能够抑制由Bax引起的烟草坏死症状。结果说明效应蛋白g11335无毒性。如图9。

图9 效应蛋白g11335的毒性验证Fig. 9 Toxicity validation of effector g11335

3 讨论

小麦矮腥黑粉菌所诱发的小麦矮腥黑穗病，被认为是对小麦的威胁最大、最难以预防的检疫性病害之一［10-11］。在环境条件适宜且存在大量感病植株时，该病害可导致50%-80%的小麦生产经济损失，甚至绝收［12］。

TCK侵染小麦之后使小麦分蘖增多，植株矮化。并且小麦的整个麦粒都变成了充满黑粉孢子的TCK黑粉菌瘿，使小麦损失严重［13］。该病害流行年份，发病率大约相当于产量减产率［14］。据报道，在美国西北部蒙大拿州的部分地方TCK发病率高达20%，而产量亏损则为45%［15］。其威力不可小觑。该病害在我国的风险评估结果表明，我国19.3%的冬小麦种植区都属于高危险区，具有适宜于TCK扩散生长的自然环境条件［16］，所以TCK一旦不能及时控制，就会威胁到我国的粮食生产，也将对我国的食品安全甚至是国民生活造成难以想象的危害。所以有必要加大对TCK生物特征、为害规律和防治技术的深入研究，对TCK实施早期预防和检疫监测，从而能够更加全面的对其进行防治。为我国的TCK防控工作提供技术储备。

由于效应蛋白是病原菌与植物之间的重要武器，在病原菌感染植物的整个过程中起着重要的作用，对小麦矮腥黑粉菌效应蛋白的研究有助于阐明小麦与小麦矮腥黑粉菌之间的互作机理。本研究成功的从TCK基因组中克隆出了编码效应蛋白的基因g11335，该基因长度为1 389 bp，编码462个氨基酸，且该基因编码的效应蛋白g11335包含了GSDH super家族的功能保守域cl26817，属于GSDH 家族的葡萄糖/山梨醇酮脱氢酶，该家族的相似家族UGDH家族和CbGDH家族，皆具有家族成员影响植物体的报道。

在对基因功能的研究中表明，亚细胞定位和基因功能之间存在着密切联系，蛋白质处在不同的细胞部位中，其执行的功能也就有所变化［17］。本研究结合EGFP即增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescence protein）在烟草中的瞬时表达技术［17-18］对g11335基因及其编码的效应蛋白进行亚细胞定位。结果表明，该蛋白质定在了本氏烟的细胞膜上，因此推测它主要在细胞膜上行使功能。研究表明，细胞膜在细胞转换物质、吸取营养、清除代谢垃圾、产生和运送蛋白质等各种处理过程中都起到着非常关键的功能［19-20］。对效应蛋白g11335进行了烟草毒性分析，结果显示该效应蛋白无毒性。这表明GSDH家族的成员葡萄糖/山梨醇酮脱氢酶很可能并不会对植物体产生毒性影响。

本文成功克隆出TCK编码效应蛋白的g11335基因，并基于基因克隆和烟草瞬时表达技术对该蛋白进行了亚细胞定位观察以及烟草毒性验证，得出该效应蛋白对本氏烟草植物体无毒性。本研究成果为进一步深入分析基因g11335及编码的效应蛋白在小麦矮腥黑粉菌中的具体功能，以及其GSDH家族成员能否影响植物体的研究奠定了基础。

4 结论

小麦矮腥黑粉菌基因g11335全长1 389 bp，共编码462个氨基酸。其所编码的效应蛋白质具有一个跨膜区，包含典型GSDH家族结构域，该家族成员可能是葡萄糖/山梨醇酮脱氢酶，具有β螺旋折叠。该蛋白的不稳定指数是34.17，属于稳定蛋白。脂肪指数为75.22，而总平均亲水性则为-0.333，是偏亲水蛋白质。效应蛋白g11335定位在本氏烟的细胞膜中，无毒性。