顶空气相法测定阿哌沙班原料中12种残留溶剂

＊陈俊泽 杨安妮 黄秀梅

（浙江永宁药业股份有限公司 浙江 318020）

阿哌沙班（Apixaban）是一种强效、口服有效的可逆、直接、高选择性的Xa因子活性位点抑制剂，可以抑制游离及与血栓结合的Xa因子，并抑制凝血酶原活性，对血小板聚集无直接影响，抑制凝血酶的产生，并抑制血栓形成[1-2]。本实验对阿哌沙班原料中有机溶剂残留进行了研究。该原料药的合成和精制过程中，需要用到甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、三乙胺、正庚烷、吡啶、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、吗啉、二甲基亚砜（DMSO）等12种有机溶剂。这些残留溶剂对人体健康有一定的不利影响，需要除去或者使其残留的量不超过2020年版《中国药典》和ICH的限度要求[3-5]。本次实验采用了气相毛细管柱顶空气相色谱法，测定了阿哌沙班工艺中涉及到的12种溶剂，并进行了方法学研究。结果显示，方法专属性强，检测灵敏度高，操作简单，结果可靠，可用于12种残留溶剂同时测定。

1.仪器与试剂

（1）仪器。Agilent7890B气相色谱仪，7697A顶空进样器，氢火焰离子化检测器（FID），Agilent工作站，HP-1毛细管柱（Agilent公司）。

（2）试剂。甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、三乙胺、正庚烷、吡啶、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、吗啉、二甲基亚砜（DMSO）、N-甲基吡咯烷酮（NMP）均为阿拉丁公司生产、GC级。阿哌沙班（浙江永宁药业股份有限公司21060201、21063001、21071401）。

2.实验方法

(1)色谱条件

色谱柱：HP-1（30m×0.530mm×2.65μm）（100%二甲基聚硅氧烷），升温程序：起始温度为40℃，维持6min，以5℃/min的速率升至80℃，维持2min，再以10℃/min的速率升至220℃，维持5min；载气：氮气；流速：2.8ml/min；进样量：1ml；进样口温度：250℃；检测器温度：250℃；分流比：5:1。样品瓶平衡温度：100℃；定量环温度：110℃；传输线温度：120℃；样品瓶平衡时间：20min；氢气流量40ml/min；空气流量400ml/min；尾吹气25ml/min。

(2)溶液配制

①对照贮备液的配制。分别称取甲醇约300mg、乙醇约500mg、乙腈约41mg、二氯甲烷约60mg、乙酸乙酯约500mg、四氢呋喃约72mg、三乙胺约500mg、正庚烷约500mg、吡啶约20mg、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）约88mg、吗啉约100mg、二甲基亚砜（DMSO）约500mg置于200ml量瓶中，用NMP稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。

②对照溶液的配制。精密量取对照贮备液5ml置50ml量瓶中，用NMP稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；精密量取对照溶液2ml至20ml顶空瓶中，加盖密封。

③供试品溶液的配制。取阿哌沙班原料（批号为：21060201、21063001、21071401）约0.1g，精密称定，分别置于20ml顶空瓶中，加入2ml NMP，加盖密封。（平行配制2份）

(3)专属性试验

取2ml NMP至20ml顶空瓶中，加盖密封，顶空进样测定，作为空白。取对照溶液和供试品溶液各2ml分别置于20ml顶空瓶中加盖密封，同法测定，记录色谱图。

(4)定量限与检测限

①定量限。分别精密量取甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、三乙胺、正庚烷、吡啶、DMF、吗啉和DMSO分别用NMP逐步稀释至一定浓度，各溶剂的定量限浓度的响应值均满足S/N≥10记录色谱图。

②检测限。取2.4.1定量限溶液，用NMP稀释3倍作为检测限溶液。各溶剂的最低检测浓度的响应值均满足S/N≥3，记录色谱图。

(5)线性和范围

取各溶剂的定量限浓度作为线性第一个浓度点；精密量取对照贮备液1mL置于50mL量瓶中，NMP稀释定容，摇匀，制成质量浓度为20%的线性溶液；精密量取对照品贮备液5ml置于100ml量瓶中，NMP稀释定容，摇匀，制成质量浓度为50%的线性溶液；精密量取对照贮备液2ml置于25ml量瓶中，NMP稀释定容，摇匀，制成质量浓度为80%的线性溶液；精密量取对照贮备液5ml置于50ml量瓶中，NMP稀释定容，摇匀，制成质量浓度为100%的线性溶液；精密量取对照贮备液3ml置于20ml量瓶中，NMP稀释定容，摇匀，制成质量浓度为150%的线性溶液。分别取各浓度点2ml，置20ml顶空瓶中，加盖密封，依次进样测定。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归。

(6)重复性试验

取对照溶液2ml分别置于20ml顶空瓶中，加盖密封，平行配制6份，顶空进样，记录色谱图。记录6份对照溶液中各溶剂的峰面积，计算RSD。

(7)溶液稳定性试验

取对照溶液2ml置于20ml顶空瓶中，加盖密封，平行配制8份，分别于0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h、30h顶空进样，记录色谱图。记录不同时间各溶剂峰面积，分别计算RSD。

(8)准确度试验

取2.5线性和范围项下浓度为50%的线性溶液，质量浓度为100%的线性溶液，浓度为150%的线性溶液作为准确度试验溶液。称取阿哌沙班（批号为：21060201）0.1g，精密称定，共12份，分别置于20ml顶空瓶中，分别精密加入NMP和各质量浓度溶液2ml，每个质量浓度平行3份，加盖密封，顶空进样测定，记录色谱图。以加入NMP的供试品作为基底空白，扣除基底空白后，计算各溶剂的回收率及回收率RSD。

(9)样品测定

取2.2.3的供试品溶液和2.2.2的对照溶液，按照2.1的色谱条件进行测定，记录色谱图，按外标法以峰面积计算溶剂残留量。

3.结果与讨论

（1）溶剂的选择。本品在合成及精制过程中使用了DMF和DMSO，但是未使用比上述两种溶剂沸点更高的NMP，且NMP能够完全溶解，且对上述12种溶剂均无干扰，故选用NMP作为溶剂。

（2）色谱柱的选择。考虑到各溶剂之间的极性差异，考察了DB-624、HP-1、DB-WAX三款色谱柱，由于要检测12种不同的溶剂，且不同色谱之间的极性及填料对溶剂的分离影响较大[6-7]，经过结果比对，最终选定了非极性的HP-1色谱柱。通过升温程序、平衡时间、平衡温度、进样口温度、流速、分流比等色谱参数的调整，确定了最终的色谱条件，使得12种不同溶剂能够有效的分离且准确检测。

（3）专属性试验。空白溶剂（NMP）对检测无干扰。甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、三乙胺、正庚烷、吡啶、DMF、吗啉和DMSO依次出峰，12个溶剂均能有效分离，各峰之间分离度均＞1.5。结果表明，使用该方法检测各溶剂之间分离效果较好。色谱图见图1。

图1 专属性色谱图

（4）定量限与检测限。①定量限。甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、三乙胺、正庚烷、吡啶、DMF、吗啉和DMSO的定量限质量浓度分别为3.1μg/ml、4.0μg/ml、2.5μg/ml、4.0μg/ml、1.5μg/ml、0.82μg/ml、0.29μg/ml、0.42μg/ml、3.8μg/ml、2.7μg/ml、6.9μg/ml、6.7μg/ml。表明使用该方法能够准确检测12种溶剂含量。②检测限。甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、三乙胺、正庚烷、吡啶、DMF、吗啉和DMSO的检测限质量浓度分别为0.93μg/ml、1.2μg/ml、0.75μg/ml、1.2μg/ml、0.45μg/ml、0.25μg/ml、0.087μg/ml、0.13μg/ml、1.2μg/ml、0.81μg/ml、2.1μg/ml、2.0μg/ml。表明该方法的检测灵敏度高。

（5）线性和范围。在验证的浓度范围内，12种溶剂线性关系良好（R＞0.999），试验结果见表1。

表1 线性关系试验结果

（6）重复性试验。甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、三乙胺、正庚烷、吡啶、DMF、吗啉和DMSO色谱峰面积的RSD分别为0.26%、0.31%、0.54%、0.91%、0.65%、0.60%、0.59%、0.66%、0.88%、1.0%、1.1%和1.1%；结果显示，该方法重复性好。

（7）溶液稳定性试验。甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、三乙胺、正庚烷、吡啶、DMF、吗啉和DMSO色谱峰面积的RSD分别为1.1%、1.3%、0.85%、0.71%、0.83%、1.8%、0.98%、1.7%、1.8%、1.3%、1.5%和1.9%，结果显示，对照溶液在室温放置30h内稳定性较好。

（8）准确度试验。甲醇的平均回收率为102.4%，RSD为1.8%；乙醇的平均回收率为101.8%，RSD为2.4%；乙腈的平均回收率为102.5%，RSD为3.1%；二氯甲烷的平均回收率为101.2%，RSD为1.6%；乙酸乙酯的平均回收率为101.1%，RSD为1.2%；四氢呋喃的平均回收率为100.1%，RSD为1.5%；三乙胺的平均回收率为98.0%，RSD为1.8%；正庚烷的平均回收率为99.8%，RSD为1.1%；吡啶的平均回收率为99.6%，RSD为1.3%；DMF的平均回收率为100.0%，RSD为1.2%；吗啉的平均回收率为99.0%，RSD为1.9%；DMSO的平均回收率为101.1%，RSD为1.7%。结果表明，回收率均符合药典规定，结果见表2。

表2 准确度试验结果

（9）样品测定。三批样品除甲醇的检出量为0.020%～0.027%，其他溶剂均未检出。结果表明，该方法能够准确检测出样品中的溶剂残留量。

4.结论

本文采用了顶空气相测定法一次性检测阿哌沙班中12种溶剂残留。方法验证结果表明：该方法的检测简便，灵敏度高，各溶剂之间分离效果好，在验证的浓度范围内，线性关系良好，回收率符合规定，符合《中国药典》2020年版通则0861残留溶剂测定法及ICH指导原则Q3C残留溶剂指导原则的规定。可作为阿哌沙班原料中质量控制方法。