气相色谱法测定羟乙基吗啉中吗啉含量的研究

邓 丽，杨宝强，谢 天

(国药集团川抗制药有限公司，四川 成都 611730)

吗啉，又称吗啡啉、1,4-氧氮杂环环己烷，具吸湿性和特殊氨味的无色油状液体，易溶于水、芳烃、醇、酮、醚和有机溶剂中。吗啉含有仲胺基团，具有仲胺基团的所有典型反应特征，如与无机酸生成盐、与有机酸生成盐或酰胺、烷基化反应、与环氧乙烷或酮进行willgerodt反应等等，羟乙基吗啉正是以吗啉和环氧乙烷反应合成而得[1-3]。

羟乙基吗啉与麦考酚酸反应可合成吗替麦考酚酯(一种免疫抑制药)，是生产吗替麦考酚酯的关键中间体。我司在研究吗替麦考酚酯课题中发现，羟乙基吗啉残留的吗啉(合成过程残留或储存过久缓慢分解产生)，极易与麦考酚酸反应生成酯类或酰胺类副产物，增加吗替麦考酚酯分离纯化的工艺难度，影响吗替麦考酚酯的质量，且存在潜在的安全性风险[4-5]。故吗替麦考酚酯合成工艺需严格控制羟乙基吗啉中吗啉的含量，尽可能减少副产物产生。但尚未见羟乙基吗啉中吗啉检测方法的文献报道。

目前，吗啉的检测方法主要有气相色谱(质谱)法[6-11]、液相色谱(质谱)法[12-13]、离子色谱法[14-15]。吗啉的分子结构决定其为几乎无紫外吸收，故液相色谱法(紫外检测器)的灵敏度和准确度效果不佳，需与质谱联用；离子色谱法尚还在探索中；气相色谱法较成熟，灵敏度高，对含吗啉的微量杂质检测比较适宜。本文首次采用气相色谱法测定羟乙基吗啉中吗啉的含量，旨在为含吗啉杂质的产品或中间体(如羟乙基吗啉)的质量控制提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪 器

7890B型气相色谱仪，(配置FID检测器)，美国美国 Agilent公司；BP211D型Sartorius电子分析天平(感量0.01mg)，上海精科仪器厂。

1.2 试 药

羟乙基吗啉(分析级)，国药集团化学试剂有限公司；吗啉(分析级)，成都市科龙化工试剂厂；甲醇(色谱级，Fisher)，羟乙基吗啉(自制，批号：Z0107、Z0501、Z0502、Z0601)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷为固定相(30 m×0.53 mm×3.0 μm)；载气：氮气；流速：3.0 mL/min；柱温条件：起始温度为150 ℃，维持3 min，以20 ℃/min速率升温至240 ℃，维持10 min；进样口温度：230 ℃；检测器温度：260 ℃；分流方式：分流进样，分流比为15:1；进样量：1 μL。

2.2 供试品溶液的制备

取羟乙基吗啉(自制)适量，精密称定，加甲醇溶解并稀释制成每1 mL中约含100 mg的溶液，作为供试品溶液。

2.3 对照品溶液的配制

分别精密称取吗啉、羟乙基吗啉各适量，加甲醇溶解并稀释制成每1 mL中分别约含吗啉1 mg、羟乙基吗啉100 mg的混合溶液，作为混合对照品溶液。取吗啉适量，加甲醇溶解并稀释制成每1 mL约含吗啉1 mg的溶液，作为吗啉对照品溶液；取羟乙基吗啉适量，加甲醇溶解并稀释制成每1 mL约含羟乙基吗啉100 mg的溶液，作为羟乙基吗啉对照品溶液。以甲醇溶液为阴性对照溶液。

2.4 方法学验证

2.4.1 专属性与系统适用性试验

精密吸取阴性对照溶液、对照品溶液和供试品溶液，依法进样，记录色谱图。结果表明，甲醇对与吗啉、羟乙基吗啉测定无干扰，专属性良好；吗啉与羟乙基吗啉峰分离度>1.5，理论塔板数>10000，满足检测要求，系统适用性良好。阴性对照、对照品和供试品色谱图见图1。

图1 吗啉和羟乙基吗啉GC图谱

2.4.2 检测限和定量限测定

吸取吗啉对照品溶液加甲醇逐级稀释后，依法进样，记录色谱图。按信噪比(S/N)约为2时作为检测限、S/N约为10时作为定量限来处理，吗啉的检测限为2.01 ng，定量限为 10.06 ng。

2.4.3 线性关系考察

取吗啉对照品溶液，加甲醇稀释2、10、20、50和100倍浓度的对照品溶液，依次进样，记录峰面积，以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归。结果表明，在吗啉在10.06～500.3 μg/mL范围内线性关系良好，其线性回归方程为：y=453.39x-4.475，R2=0.9995。

2.4.4 精密度试验

吸取吗啉对照品溶液，依法连续进样6次，记录吗啉的峰面积。结果，吗啉峰面积的RSD=1.67%。

2.4.5 重复性试验

取羟乙基吗啉样品(批号：Z0107)，按“2.2供试品溶液的制备”项平行制备供试品溶液6份。依法进样，记录峰面积，按外标法计算样品中吗啉的含量，结果见表1。

表1 重复性试验结果

2.4.6 加样回收率试验

精密称取吗啉42.15 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；再从中吸取1mL置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为吗啉对照品储备液。取已知含量样品(批号：Z0107)9份，每份约0.5 g，分别置10 mL量瓶中，将9份样品分成3个组，每组3个平行，吸取吗啉对照品储备液0.25 mL、0.50 mL、0.75 mL各3份置9个样品中，加甲醇定容至刻度，摇匀，作为加样回收率供试品溶液。依法进样，记录色谱图，按外标法计算供试品溶液中吗啉的测得量，并计算回收率。

表2 加样回收率试验结果

2.4.7 耐用性试验

取羟乙基吗啉样品(批号：Z0107)的供试品溶液，将“2.1色谱条件”作微调，调整色谱柱初始温度、进样口与检测器温度、分流比，记录峰面积，计算样品中吗啉含量。

表3 耐用性试验结果

2.4.8 样品测定

取三批样品(Z0501、Z0502、Z0601)各约1 g，按“2.2供试品溶液的制备”项制备供试品溶液，依法进样，记录峰面积，按外标法计算样品中吗啉的含量，见表4。

表4 三批羟乙基吗啉样品中吗啉含量测定结果

3 结 论

羟乙基吗啉是由适量的环氧乙烷和过量的吗啉合成制得，由于吗啉和羟乙基吗啉结构相似，吗啉极有可能残留在羟乙基吗啉中，两者化学性质也存在相似之处，检测过程中分离度难以符合要求。

以羟乙基吗啉作为药物组成部分或者作为中间体反应合成吗替麦考酚酯，都有必要对杂质吗啉进行研究。本研究首次采用气相色谱法测定羟乙基吗啉中吗啉的含量，方法学考察结果表明，在选定的色谱条件下，吗啉与羟乙基吗啉能够完全分离，空白溶剂无干扰、系统适用性良好、灵敏度高、在10.06～500.3 μg/mL范围内线性关系良好、重复性良好和准确度高，可有效控制极微量吗啉的含量。

本研究所建立的气相色谱法测定羟乙基吗啉中吗啉含量的方法切实可行，操作简单，将会为含有吗啉的杂质的产品或中间体质量研究提供依据。