3.74 μm远红外激光致小鼠角膜损伤修复观察

尹贻雪，焦路光，王嘉睿，王 超，任子淇，赵乙珑，郑 红，杨在富*

（1. 安徽医科大学基础医学院，合肥 230032；2. 军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所，北京 100039）

处于大气传输窗口的3～5 μm远红外激光在分子光谱学［1］、环境遥感［2］、红外光电对抗［3］等领域有重要的应用价值。近年来，随着红外光参量振荡器（optical parametric oscillator，OPO）技术的发展［4-7］，该波段的激光器已经实现小型化和较高功率输出，极大地促进了该光谱区段的开发和应用，但其对人身健康的危害也应引起足够重视。人眼是激光损伤最重要的靶器官。红外（0.7 μm～1.0 mm）激光具有强烈的“水吸收”作用［8］，人眼受到该波段激光照射时，辐射能量主要被含水量丰富的角膜组织吸收，通过热效应造成角膜损伤［9］。角膜被红外激光损伤后可造成混浊、瘢痕、不透明甚至失明，危害严重，是近年来激光损伤防护研究的重要方向［10-12］。以往的红外激光角膜损伤研究主要集中在近红外（0.7～1.4 μm）和中红外（1.4～3.0 μm）波段，包括波长1.315 μm的氧碘化学激光（chemical oxygen-iodine laser, COIL）［13］、波长1.319 μm的钇铝石榴石晶体（yttrium aluminium garnet，YAG）激光［14-16］、波长1.338 μm的YAG激光［10］、波长1.54 μm的铒（erbium，Er）激光［17-19］、波长2.0 μm的铥（thulium，Tm）激光［20-22］、波长2.94 μm的自由电子激光 （free electron laser，FEL）［23］等。远红外波段（3 μm～1 mm）激光角膜损伤的研究主要集中在波长为10.6 μm的CO2激光上［24］。目前，3～5 μm波段激光角膜损伤的研究尚未见报道。我们前期通过试验研究确定出了处于该波段的3.74 μm激光兔角膜损伤阈值［25］。本文在前期研究的基础上，构建3.74 μm激光小鼠角膜损伤模型，观察激光角膜损伤特点和损伤修复过程，为激光角膜损伤危害评价和损伤治疗研究提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验对象

C57BL/6J小鼠（Mus musculus）30 只，6～8 周龄，体重25～30 g，雌雄不限，由北京斯贝福实验动物养殖中心提供，在军事医学研究院实验动物中心饲养。经裂隙灯显微镜和检眼镜检查，小鼠眼屈光介质和眼底均正常。

1.2 仪器

远红外激光器由国防科技大学提供，波长为3.74 μm。采用光参量振荡技术，输出激光中包含1.06、1.50和3.74 μm三个波长，发射方式为连续输出。滤除1.06和1.50 μm激光，保留3.74 μm激光，其最大功率为12.8 W。

1.3 光路搭建

3.74 μm激光依次经过楔形分束片、凸透镜、快门、反射镜后垂直入射到小鼠角膜，光路中所有光学元件均为适合于远红外透射传输的CaF2材质。楔形角为8o的楔形分束片分出的部分激光，照射到激光功率计1（power meter 1，PM1）上，用于监测激光照射过程中的功率。另一个激光功率计2（power meter 2，PM2）测量到达小鼠角膜处的激光功率。焦距为500 mm的凸透镜用于改变光束直径，调节角膜光斑大小，凸透镜与小鼠眼角膜间的距离为28.3 cm，此处光斑直径为2 mm。机械快门控制曝光时间为0.8 s。两个低功率的655 nm激光笔发射的激光束交叉点与3.74 μm激光光斑中心重合，用于精确指示小鼠角膜位置。试验前先测出PM2与PM1读数的比值即监视比，角膜照射时撤掉PM2，根据PM1读数和监视比计算出实际辐射功率。通过调整激光器驱动电流，激光照射角膜的功率可自由改变。

1.4 构建小鼠角膜激光损伤模型

试验前30 min，30 只C57BL/6J小鼠采用5%水合氯醛（750 mg/kg）腹腔注射全身麻醉，然后用盐酸奥布卡因滴眼液表面麻醉。将小鼠固定在升降台上，微调小鼠眼的位置和角度使激光束照射角膜中心。根据本研究前期试验结果［23］，光照时间为1.0 s、光斑直径为1.5 mm的条件下，3.74 μm远红外激光致兔角膜损伤阈值为7.91 J/cm2。依据该数据，预试验分别用大约2 倍、3 倍、4 倍阈值剂量激光照射小鼠角膜，每个照射剂量1 只小鼠，摸索可导致热凝固损伤但不会发生角膜缺损或穿孔（中度损伤）的激光照射条件，得出能量密度为23.2 J/cm2，对应的激光照射功率为0.91 W。正式试验时，每只眼仅照射一个光斑，照射位置尽量靠近角膜中心。对照组为3只小鼠，试验组为照后3 h、6 h、12 h、1 d、3 d、7 d、14 d、21 d等8个时间点，每个时间点3只小鼠。

1.5 大体观察

在激光损伤后各观察时间点，肉眼或借助放大镜观察小鼠角膜损伤斑情况，用数码相机拍照记录。

1.6 裂隙灯显微镜观察

在激光损伤后各观察时间点，用TOPCON裂隙灯显微镜观察小鼠角膜损伤情况，观察方法包括大光斑斜照法以及窄裂隙照明法，评估角膜混浊程度、损伤深度，并拍照记录。

1.7 光学相干断层扫描（optical coherence tomography, OCT）

在激光损伤后各观察时间点，采用光学相干断层扫描仪（Cirrus HD-OCT 5000）对小鼠角膜损伤区进行断层扫描，并进行拍照记录。用Cirrus HD-OCT系统自带标尺测量损伤中心的角膜厚度，用于统计分析。

1.8 组织病理观察

在激光损伤后各观察时间点，颈椎脱臼处死小鼠，摘取眼球，快速置入甲醛-乙酸固定液（10%中性甲醛80 mL，乙酸20 mL）固定24 h［26］，固定后标本经梯度酒精脱水，二甲苯使之透明，石蜡包埋后制作4 μm切片，苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE），中性树脂封片，光学显微镜下进行病理切片的观察和拍照。

1.9 统计分析

使用SPSSv23.0统计软件包对Cirrus HD-OCT测得的损伤中心角膜厚度进行统计分析，数据以平均值±标准差（±s）表示，采用Student’sttest比较损伤后各个时间点与损伤前厚度是否有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 大体观察

图1 3.74 μm远红外激光致小鼠角膜损伤光路示意图Fig. 1 Schematic drawing of 3.74 μm laser set up for the mice corneal exposure

如图2所示，C57BL/6J小鼠正常角膜表面光滑，清澈透明。3.74 μm远红外激光所致角膜损伤即刻可见为灰白色凝固斑，损伤后3～12 h角膜表面凹凸不平，角膜混浊程度随时间逐渐加重，1 d时最重，3～7 d逐渐减轻，14 d再次加重，21 d角膜仍不透明，未恢复正常。另外，激光损伤后12 h可见上下眼睑肿胀和分泌物增多，1 d时症状最为明显，其后逐渐消退。

图2 3.74 μm远红外激光损伤角膜后损伤斑的变化Fig. 2 Corneal lesions under digital camera after 3.74 μm laser irradiation

2.2 裂隙灯显微镜观察

大光斑斜照法观察（图3a）正常角膜透明度高，其后方的虹膜和瞳孔清晰可见。3.74 μm远红外激光损伤后，角膜混浊非常明显，后方虹膜和瞳孔被遮挡不可分辨，角膜混浊随时间的变化特性与大体观察一致。损伤后6 h混浊区扩展至损伤斑周边，1 d时混浊面积达到顶峰，3～7 d混浊面积明显减小，14 d混浊再次加重，21 d角膜未恢复正常。

窄裂隙照明法观察发现（图3b）：正常角膜光散射弱，为厚薄均匀的淡灰白色条带，虹膜清晰可见；角膜受损后光散射显著增强，为亮白色条带，损伤累及角膜全层，损伤区角膜增厚，虹膜模糊；白色条带随时间先增强后减弱，1 d时条带最显著，21 d时角膜厚薄仍不均匀，未恢复正常。

图3 裂隙灯显微镜观察3.74 μm远红外激光损伤角膜后损伤斑的变化Fig. 3 Corneal lesions under slit lamp microscope after 3.74 μm laser exposure

2.3 OCT观察

OCT观察正常角膜为亮度均匀的高反射光带。3.74 μm激光损伤后，损伤区角膜反射光带增强，角膜凸起明显；反射光带增强区域随时间先扩大后逐渐缩小，1 d时反射光带增强区域达到最大，21 d时角膜损伤区反射光带仍较强，未恢复正常（图4）。此外，损伤后6 h～1 d可观察到虹膜与角膜黏连（但无法判断虹膜是否与晶状体黏连）。

图4 OCT观察3.74 μm远红外激光损伤角膜后的损伤区的变化Fig. 4 Corneal lesions under OCT after 3.74 μm laser exposure

激光损伤引起角膜肿胀，角膜厚度随时间先增大后减小，12 h时最厚，达（218.30±8.18）μm，约为正常角膜厚度的2 倍；21 d角膜厚度基本恢复正常（图5）。

图5 3.74 μm远红外激光损伤后角膜厚度的变化Fig. 5 The thickness of corneal after injury induced by 3.74 μm laser

2.4 组织病理观察

HE染色观察发现：正常小鼠角膜组织结构清晰，上皮层由4～5 层上皮细胞构成，排列规整；基质层纤维规则排列，包含梭形基质细胞；内皮层为单层内皮细胞均匀分布。3.74 μm激光致C57BL/6J小鼠角膜损伤后3 h，上皮细胞核固缩深染，成拉伸状，基质细胞核染色质大部分脱失，仅有少量残存，内皮细胞完全脱落；6 h上皮细胞核染色变淡，基质细胞核染色质消失，出现无核区，后表面平整；12 h上皮层不再平整，出现皱褶，上皮细胞核染色消失，基质层出现浸润细胞，基质后表面皱褶弯曲；1 d坏死上皮脱落，1～2 层新生上皮细胞完全覆盖损伤区，细胞排列不规则，基质层浸润细胞增多，基质后表面出现零星椭圆形核的内皮细胞；3 d上皮层细胞增多，出现单层扁平上皮，表面恢复平整，基质层浸润细胞进一步增多，且多集中在深层，内皮层椭圆形内皮细胞增多；7 d新生上皮增加到3～4 层细胞，大量细胞呈空泡状，基质浸润细胞多集中在浅层，扁平内皮细胞呈单层分布，恢复平整；14 d 上皮层有少量空泡细胞，排列趋向规整，基质层浸润细胞减少；21 d上皮层基本恢复正常，厚薄均匀，由4～5 层排列规整的上皮细胞构成，单层内皮细胞均匀分布，铺满内皮层，基质层浸润细胞进一步减少，基质层出现空隙，基质纤维排列仍不规则，未恢复正常（图6）。

图6 3.74 μm中红外激光照射角膜损伤病理切片Fig. 6 Corneal histological sections after 3.74 μm laser exposure

组织病理显示：损伤后6 h虹膜与角膜黏连；12 h虹膜组织碎裂，部分与角膜黏连，部分与晶状体黏连；1 d可见虹膜与角膜缘黏连，偶见与晶状体黏连（图7），说明虹膜也已经受损。上述虹膜与角膜黏连的特征与OCT观察结果一致。

图7 3.74 μm远红外激光致角膜损伤后组织黏连的病理切片Fig. 7 Iris adhesion to the cornea or lens revealed by histological sections after 3.74 μm laser exposure

3 讨论

本研究中，我们构建了3.74 μm远红外激光致C57BL/6J小鼠角膜热凝固损伤模型，损伤累及小鼠角膜全层，损伤后角膜肿胀增厚，混浊随时间加重，随着受损上皮细胞脱落以及水肿消退，角膜变薄，混浊减轻。新生上皮细胞迁移覆盖损伤区，先形成1～2 层细胞组成的薄层上皮，然后逐渐增厚形成接近完整的正常上皮；基质层受损基质细胞核染色质消失，出现浸润细胞，其自房水途经受损内皮进入基质深层，进而迁移至基质浅层。21 d浸润细胞退去，基质层胶原纤维未恢复正常结构；受损内皮细胞脱落，新生内皮细胞迁移覆盖损伤区，形成均匀分布的单层扁平结构。

与本试验中3 倍阈值剂量造成小鼠角膜全层损伤特征不同，该激光致新西兰白兔角膜阈值损伤研究的观察只持续到24 h。在阈值水平损伤仅累及角膜上皮层，损伤后上皮坏死脱落，24 h上皮层即可恢复正常［25］。2 倍阈值剂量的损伤累及角膜上皮层和浅层基质，损伤后6 h上皮坏死脱落，浅层基质细胞核染色质大部分脱失；24 h可见上皮层基本恢复正常，浅层基质细胞核染色质消失，未恢复正常［25］。本试验眼损伤明显偏重，原因一方面是激光照射剂量高，另一方面是小鼠角膜厚度低。

就动物模型的选择上，角膜损伤阈值研究多以兔作为动物模型［13-24］，而角膜损伤修复研究则多以小鼠作为动物模型［27-29］。3～4月龄兔角膜厚度在350～380 μm［30］，而6～8 周龄C57BL/6J小鼠的角膜厚度为85～95 μm［31］。3.74 μm激光在1.97 倍损伤阈值条件下损伤累及兔角膜上皮层和基质浅层，损伤深度约是兔角膜厚度的一半［25］；按损伤深度推断，本试验所用照射剂量不仅能损伤小鼠角膜全层，还包括角膜后组织。因此，在损伤修复中观察到虹膜与角膜黏连，或者虹膜与晶状体黏连的现象。总之，本研究通过观察3.74 μm远红外激光在23.2 J/cm2的剂量下致小鼠角膜损伤后的修复过程，为红外激光角膜损伤修复研究提供了试验依据。