用于生物体内甲醛可视化检测的小分子荧光探针的研究进展

赵 予，张 涛*

（1. 华南师范大学生物光子学研究院，激光生命科学教育部重点实验室，广州 510631； 2. 华南师范大学生物光子学研究院，广东省激光生命科学重点实验室，广州 510631）

作为活性最高的活性羰基物种（reactive carbonyl species，RCS），甲醛（formaldehyde，FA）具有较高的反应活性，可以与体内的氨基、羟基、巯基等各种生物亲核试剂反应，造成生物大分子（如蛋白质和核酸）的变性或变异［1-4］。由于甲醛的致癌性和致突变性，长时间、高浓度的甲醛暴露会引发各种疾病，如阿尔茨海默病、DNA修复抑制、白血病、新生儿染色体疾病、过敏性肺炎、记忆力受损和核基因突变［2，5-9］。因此，长期以来甲醛都被认为是一种人体毒素和致癌物。世界卫生组织（World Health Organization，WHO）和美国国家环境保护局（United States Environmental Protection Agency，US EPA）［10］建议每天可耐受的甲醛摄入量分别为0.15和0.20 mg/kg。

环境中的甲醛分为自然（微生物排放、植被和腐殖质降解、生物质燃烧等）排放和人为（汽车尾气、建筑材料、熏蒸、工业生产甲醛等）制造。而内源性的甲醛在重要的生物代谢途径中都有持续的产生，如表观遗传学（组蛋白/DNA去甲基化）、一碳代谢、单碳载体四氢叶酸（tetrahydrofolic acid，THF）及其一些衍生物的氧化降解［11-13］。同时体内存在重要的乙醇脱氢酶系统（alcohol dehydrogenase，ADH），用于降解过量的甲醛［14-15］。细胞内甲醛代谢始于细胞抗氧化剂谷胱甘肽（glutathione，GSH）。它与甲醛自发反应产生S-羟甲基-GSH，该化合物进一步被ADH氧化，从而抑制内源性甲醛的异常积累，维持体内甲醛浓度的稳定。血液中甲醛的正常水平约为0.08 mmol/L，大脑中的浓度为0.20～0.40 mmol/L［16］。内源性甲醛在许多生理过程中发挥着重要作用，如与空间记忆密切相关［17］，甚至作为一碳单位的供体可以维持一碳代谢功能缺失的细菌的存活。体内甲醛含量的稳定对于人体的健康具有非常重要的意义，其潜在的生理效应已越来越受到重视。破译甲醛的生理或病理功能的一个主要挑战是难以实时测量其在细胞和组织中的浓度、持续时间和位置。

检测甲醛的方法已有比色法、气相色谱法、气相色谱-质谱法、紫外光谱法等。然而，这些方法通常具有灵敏度低、操作复杂、需要侵入性破坏生物组织等局限性［18］。与它们相比，有机小分子荧光探针具有灵敏度高、膜通透性好、实时原位分析、生物损伤小、操作方便等显著优势，是能够在时间和空间上实时监测细胞内甲醛浓度与分布的一种强大的非侵入性工具。因此，甲醛荧光探针越来越多地受到研究人员的关注，开发具有高灵敏度和高选择性的甲醛荧光探针逐渐成为研究热点。本文将基于反应型甲醛荧光探针的响应机理和应用方向，总结甲醛探针的发展历程，并对甲醛探针的后续研发方向作出展望。

1 基于氨基或肼生成席夫碱（Schiff base）的甲醛探针

在早先设计和开发检测甲醛的探针时，肼或氨基通常用作选择性反应单元。甲醛与氨基和肼反应形成相应的亚胺（席夫碱），显示出显著不同的发射和吸收特性，用于甲醛的检测。

甲醛和氨基官能团的缩合反应生成了最简单的席夫碱（亚胺）（图1），该缩合反应是检测甲醛的有效方式。基于这一反应，许多用于甲醛检测的荧光探针被设计并开发了出来。2012年，Song等［19］首次报道了一种基于席夫碱反应的甲醛选择性检测策略，在探针AnB中（图2），由于苯氨基团对BODIPY骨架部分有光致电子转移（photoinduced electron transfer，PET）荧光猝灭效应，探针AnB在535 nm处显示出微弱的荧光。然而，随着甲醛的逐渐添加，苯氨部分发生席夫碱反应形成亚胺化合物AnB-a，PET效应得以消除，分子AnB-a在535 nm处的发射强度逐渐增加。基于其荧光响应的甲醛检测限为165 nmol/L，具有较高的灵敏度。

图1 基于席夫碱反应的甲醛检测方案Fig. 1 Formaldehyde detection scheme based on Schiff base reaction

图2 基于氨基的甲醛探针AnBFig. 2 Amino-based formaldehyde probe AnB

为了开发具有近红外波长（near infrared reflectance，NIR）吸收发射的甲醛探针，Ding等［20］合成了氨基半菁染料检测食品和小鼠体内的甲醛。探针NIR-NH2的氨基在与甲醛反应形成席夫碱后，PET效应得以开启，探针NIR-NH2在670 nm的吸收增加，708 nm处的荧光发射减弱，对于甲醛的检测限为1.87 μmol/L。虽然探针NIR-NH2的荧光发射为近红外区域，但是其为响应关闭型（on-off）探针，即甲醛浓度越高荧光强度越弱，并不利于探针的实际应用。

除了利用席夫碱的PET效应外，Chen等［21］利用氨基变成亚胺后水溶性变差的特性，设计出了第一个基于聚集诱导发射（aggregation-induced emission，AIE）的甲醛探针AIE-FA（图3），该探针对于甲醛的检测限为40 nmol/L，响应时间约为90 s。此外，其特异性检测内源性和外源性甲醛的能力在活细胞中得到了证实。

图3 甲醛探针AIE-FA成像机理［21］Fig. 3 Formaldehyde probe AIE-FA imaging mechanism［21］

Ding等［22］将PET的失活和荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）的激活过程相结合，设计出探针CmNp-CHO，用于真实食品样品、活细胞、组织和斑马鱼中甲醛的比率检测。最初，探针CmNp-CHO由于萘二甲酰亚胺部分PET效应开启和萘酚FRET效应的关闭，其荧光发射主要是萘酚位于426 nm的发射峰（图4a）。随着该探针与甲醛的反应，萘二甲酰亚胺部分的PET效应关闭，萘酚的荧光发射FRET到萘二甲酰亚胺部分。探针在426 nm处的发射强度显著降低，550 nm处的发射强度增加，颜色由蓝色变为黄色。因此，该探针可用于HeLa细胞中甲醛的比率成像（图4b）。荧光强度比（I 550/I 426）与甲醛浓度在0～12.0 mmol/L范围内呈良好的线性关系，甲醛检出限为（8.3±0.3） nmol/L。

图4 基于FRET效应的甲醛探针CmNp-CHO［22］Fig. 4 Formaldehyde probe CmNp-CHO based on FRET effect［22］

肼与氨基一样具有强亲核性，可以和甲醛反应生成腙，同样可以用于甲醛的检测。Chen等［23］将扭曲分子内电荷转移（twisted intramolecular charge transfer，TICT）机理用于甲醛的检测，合成了探针BHA。探针BHA在与甲醛反应生成腙后，从TICT切换到分子内电荷转移（intramolecular charge transfer，ICT）（图5a）状态，探针的荧光开启（＞900倍）。该探针对甲醛的响应速度快（＜30 min），检测下限低（0.18 μmol/L），选择性高，细胞毒性小。此外，探针BHA还成功实现了活细胞内源性和外源性甲醛的检测。

通过理论计算，BHA的激发态结构为非共平面结构，肼基团与BODIPY分子骨架之间的角度为50.97°，此时主要是无荧光的扭曲的分子内电荷转移过程。而与甲醛反应后，分子BHA-a的激发态结构中该角度变为4.87°，几乎为共平面，此时TICT过程消失，主要为ICT荧光发射过程（图5b）。理论计算很好地解释了即使肼比腙具有更强的供电子能力，但是BHA分子与甲醛反应后吸收波长的红移和荧光发射强度增强这一试验现象。

图5 基于TICT效应的甲醛探针BHA［23］Fig. 5 Formaldehyde probe BHA based on the TICT effect［23］

以上基于氨基或肼的甲醛检测探针虽然能够实现对甲醛的快速检测，但是生物体内含有大量的其他RCS，如乙醛、甲基乙二醛和吡哆醛等。这些活性物质的羰基或醛基同样能跟氨基或肼发生反应，干扰该类探针对于甲醛的特异性检测。

为了实现对甲醛的特异性检测，Liu等［24］合成了探针L，它是一种邻苯二氨和罗丹明衍生物，用于区分和检测甲醛、甲基乙二醛（methylglyoxal，MGO）和其他醛类物质。探针L的检测原理是基于探针和分析物之间的反应动力学差异，以及反应产物的荧光特性的差异。该探针在单波长激发下对甲醛（荧光增强）和MGO（荧光红移和减弱）显示出不同的响应模式，可用于活细胞中甲醛和MGO的检测成像。

为了进一步提高苯二氨基团对于甲醛的选择性，Cai等［25］选择正丙基和异丙基来修饰邻苯二氨中的氨基，以提供不同的空间位阻，用于区分甲醛和其他醛类。在试验中，具有较大空间位阻的探针NP在成像细胞内源性甲醛方面表现出了更好的特异性，验证了通过提高空间位阻来区分甲醛和其他复杂的醛类的可能性，为后续的甲醛探针的设计提供了思路。

虽然该方式有效地提高了基于氨基检测方式对于甲醛的选择性，但是一氧化氮（nitric oxide，NO）仍然可以对该类探针造成非常大的干扰［26-28］，因此，提高甲醛探针的特异性仍是一个巨大的考验。

2 基于Aza-Cope重排反应的甲醛探针

如图6所示，烯丙基氨基团可以与甲醛发生Aza-Cope重排反应，随后亚氨化合物水解生成醛［29］。该反应对于甲醛具有较高的选择性，因此可用于对甲醛的特异性检测。

图6 基于Aza-Cope重排反应的甲醛检测方案Fig. 6 Formaldehyde detection scheme based on Aza-Cope rearrangement reaction

基于Aza-Cope重排反应，Roth等［30］首先设计了探针FP1。该探针被4-硝基苯取代，在没有甲醛的情况下该分子发生d-PET荧光淬灭过程，与甲醛发生反应后硝基苯部分离去，PET效应被抑制，荧光强度恢复（图7a），在PBS缓冲溶液中甲醛的检测限为0.01 mmol/L。另一方面，其他竞争性分析物不能导致探针的荧光强度变化，表明该探针对于甲醛具有良好的特异性。FP1探针被用于体外神经元模型细胞Neuroscreen-1（NS1）细胞中外源性甲醛的检测，随着外加甲醛浓度的提高，细胞的荧光强度也显著增加（图7b～7e）。

图7 基于Aza-Cope重排反应的甲醛探针FP1［30］Fig. 7 Formaldehyde probe FP1 based on Aza-Cope rearrangement reaction［30］

以上探针建立了基于化学反应的荧光方法用于监测生物体内甲醛的前景，但仍有重大改进的空间。一个需要解决的关键问题是，只有相对较少的染料骨架被报道用于甲醛检测。因为绝大多数甲醛探针通过直接修饰染料骨架来引发荧光反应，因此，通过修改响应基团以提高染料对于甲醛的反应性和选择性往往会同时扰乱染料的光物理性质。这种合成上的限制限制了甲醛探针的激发/发射峰调节，不利于近红外甲醛荧光探针的开发。

为了解决这个问题，Bruemmer等［31］基于Aza-Cope反应，开发了一种通用的响应后离去型甲醛检测基团（图8a），含有一个甲醛反应基团和一个通过β消除自离去的连接物，可以连接到任何含有苯酚基团的荧光团上用于甲醛的检测。

作者将该响应基团连接在多种羟基染料上，合成了具有不同吸收和发射波长的甲醛响应探针（FAP385、FAP498、FAP555、FAP573）（图8b），在498～585 nm范围内对于细胞内甲醛实现了线性检测。其对于甲醛具有较好选择性的同时，也具有较低的检出限，更为重要的是，该响应方式为近红外一窗和二窗（NIR I、NIR II）的甲醛检测探针的开发提供了可能性。该响应方式对甲醛具有高度的特异性，然而它们的反应动力学是缓慢的，检测时间长达60～180 min，这对于检测甲醛这种具有高反应活性和瞬时性（在生物体中的检测半衰期约为90 s）［32］的物质是极为不利的。因此，缩短该检测基团的响应时间对于实时监测生物体内甲醛浓度具有重要意义。

图8 基于Aza-Cope离去基团的甲醛探针［31］Fig. 8 Formaldehyde probe based on Aza-Cope leaving group［31］

为了达到这一目的，Quan等［32］合成了一种基于激发态分子内质子转移（excited state intramolecular proton transfer，ESIPT）的比率荧光探针FormAFP。在甲醛存在时，经过Aza-Cope重排和β消除生成烯醇式HBT-enol，通过质子转移生成酮式不溶性染料HBT-keto，通过烯醇-酮互变异构实现对甲醛的比率传感（图9）。虽然甲醛检测基团和反应途径相同，但是相对于探针FAP系列需要180 min的响应时间，探针FormAFP在10 min内就能响应完全，作者将这种不同的反应性归因于响应前后探针水溶性的差异。

图9 探针FormAFP与甲醛的反应机理［32］Fig. 9 Reaction mechanism of probe FormAFP with formaldehyde［32］

烯丙基氨在作为探针FormAFP的甲醛反应基团的同时，也作为亲水性基团增加了探针FormAFP的水溶性。在甲醛的存在下，探针FormAFP的烯丙基氨离去，生成在水溶液中不溶解的产物HBTketo。HBT-keto是一种典型的沉淀型染料，由于分子内的氢键分子，HBT-keto在水相和有机相中都具有较低的溶解度［33］。虽然该探针的有效缩短是基于Aza-Cope重排甲醛检测方式的响应时间，但是其应用对象为基于ESIPT的沉淀染料，对于普通荧光染料并不通用。因此，该快速响应方式的通用性仍是一个巨大的挑战。

3 总结与展望

荧光探针是原位和实时检测甲醛的重要工具。越来越多的甲醛荧光探针被开发出来，用于细胞中内源性和外源性甲醛的检测。本文综述了近年来甲醛荧光探针的研究进展，重点介绍了几种主要检测方式的发展历程和检测机理。

已有的甲醛荧光探针多数基于氨基、肼和双氨基的席夫碱的生成和Aza-Cope重排等几种经典化学反应，同时结合PET、ICT、AIE、FRET、TICT、ESIPT等荧光开启策略，实现了对于生物体内源性和外源性甲醛的检测。这些荧光探针分别具有特异性强、灵敏度高、响应时间短和通用性强等优点。但是，大多甲醛探针很难同时具备上述多种优点，各自有着明显的缺点，如基于席夫碱反应的荧光探针其特异性和通用性具有很大的限制，基于Aza-Cope重排的荧光探针响应时间极其漫长，这些缺点都限制了这些探针在生物体内的进一步应用。

甲醛具有高反应活性，是一种半衰期非常短的活性物质。良好的甲醛探针应该同时具备上述特异性强、灵敏度高、响应时间短和通用性强等优点。同时，探针的激发和发射波长越长，越有利于减少生物体自身荧光串扰和提高成像深度。因此，基于近红外（NIR I、 NIR II）吸收和发射的甲醛荧光探针的设计和合成是今后甲醛荧光探针的主要研究目标。另外，基于化学反应的甲醛探针，在检测甲醛的过程中会使甲醛局部浓度改变，进一步导致甲醛稳态失衡。开发出甲醛可再生的可逆甲醛荧光探针以防止化学副产物的产生和维持检测区域原有甲醛浓度，这对于破译甲醛的生理学或病理学功能是非常必要的。对甲醛荧光探针机理的详细了解可以帮助化学家开发预期的近红外甲醛检测探针，这将有助于突破当前甲醛荧光探针的局限性。我们希望这种对传感机制的讨论和对最新进展的总结，对于进一步设计和开发用于选择性甲醛检测的分析物可再生的近红外甲醛荧光探针有所帮助。