肝癌组织中miR-7-5p、UbcH10表达水平与患者临床预后的相关性研究

檀喜玲,冯 喆,高 芳

1.邯郸市人民医院消化内科，河北邯郸 056009;2.邯郸市中心医院普外科，河北邯郸 056001;3.邯郸市第一医院普外科，河北邯郸 056002

据WHO公布的数据显示，原发性肝癌(简称肝癌)是一种发病率居第6位、死亡率居第2位的常见恶性肿瘤，其中乙型肝炎病毒相关细胞癌和丙型肝炎病毒相关细胞癌占比约为80.00%[1]。肝癌早期无特异性症状，多数患者确诊时已进展至中晚期，且手术治疗后5年内的死亡率高达50.00%[2]。因此，寻找高灵敏度、高特异度的分子标志物用于肝癌的早期诊断和预后评估成为临床研究的热点。微小RNA(miRNA)是一类由21～23个碱基组成的非编码单链RNA,通过种子序列与靶细胞的3′UTR相结合，促进靶基因miRNA降解或抑制蛋白翻译过程，负调控靶基因的表达[3]。miRNA-7是miRNA成员之一，miRNA-7-5p是miRNA-7的成熟体，其已被证实可靶向控制P13K/Akt、FAK等基因来抑制肿瘤细胞增殖和侵袭[4]。泛素结合酶UbcH10是第10个被识别的人泛素结合酶，作为一种调节细胞周期的蛋白，能够与细胞促进复合物的相互作用来驱动有丝分裂的后期转换[5]。已有研究表明，UbcH10参与了非小细胞肺癌、脑胶质瘤等多种肿瘤的发生和进展的过程[6-7]。目前，miR-7-5p及UbcH10与原发性肝癌的相关研究较少，本研究通过测定该两种生物标记物在肝癌组织中的表达情况，分析其与肝癌病理特征及预后的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料 回顾性分析2017年12月至2018年12月间在邯郸市人民医院(下称本院)行肝癌切除手术治疗的57例患者临床资料，术中分别采集肝癌组织和癌旁组织(距离癌灶>5 cm)57份。男34例，女23例；年龄53～68岁，平均(59.3±3.7)岁；肿瘤最大径>5 cm者30例，≤5 cm者27例；分化程度：高分化11例、中分化32例、低分化14例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期31例，Ⅲ～Ⅳ期26例；包膜形成：有包膜37例、无包膜20例；门静脉侵犯：侵犯25例，未侵犯32例；乙型肝炎表面抗原(HBsAg)检测结果：阳性47例，阴性10例。纳入标准：(1)所有患者均行手术治疗，术后病理诊断为肝癌；(2)临床及术后随访资料真实完整；(3)预计生存期>3个月；(4)所有患者及家属对试验知情且签署同意书。排除标准：(1)合并其他部位恶性肿瘤；(2)伴原发性肾功能障碍者；(3)伴不稳定系统性疾病者；(4)行放化疗治疗者。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2试剂与仪器 miR-7-5p与阴性对照(miR-NC)购自上海吉玛公司；Trizol试剂、脂质体 Lipo2000购自美国赛默飞世尔公司；PCR引物及RT-PCR试剂盒购自日本TAKARA公司；UbcH10引物由上海生工公司提供，UbcH10多克隆体购自Santa Crus公司。

1.3方法 取术中采集的新鲜肝癌组织及癌旁组织各100 mg，加入1 mL Trizol至样本中裂解，提取总RNA，使用超微两紫外分光光度计检测RNA水平、纯度，再以总RNA为模板反转录合成cDNA，再以cDNA为模板PCR扩增，分别以U6、GAPDH为内参。miR-7-5p及UbcH10引物序列分别由TAKARA、Santa Crus公司设计合成。引物序列见表1。

表1 miR-7-5p、UbcH10行qPCR检测的引物序列

PCR检测反应体系：按照说明书配置反应液20 μL，模板cDNA 1 μL，dNTPmix 12.5 μL，dH2O 9.5 uL，上下游引物各1 μL。miR-7-5p PCR反应条件：95 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，40个循环；95 ℃ 10 s受热变性，再以每2 s递增0.5 ℃，65～85 ℃行温度梯度退火。UbcH10 PCR反应条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30个循环。使用2-ΔΔCt法计算组织标本中miR-7-5p，UbcH10表达水平。

1.4随访 所有患者术后通过门诊复查、电话等方式随访，随访频率为3个月1次，随访终点时间为2021年10月或患者死亡。复发：治疗后血清甲胎蛋白水平明显升高，且影像学检查显示有新的肿瘤灶；进展：影像学检查显示肿瘤两个最大相互垂直直径乘积>25.00%；本研究未出现失访情况，随访率为100.00%。

2 结 果

2.1miR-7-5p、UbcH10在肝癌组织及癌旁组织中的表达水平 肝癌组织中miR-7-5p表达水平明显低于癌旁组织，差异有统计学意义(t=22.125,P<0.001)，而UbcH10表达水平显著高于癌旁组织(t=26.812,P<0.001)，差异有统计学意义(P<0.05),见图1。

图1 miR-7-5p、UbcH10在肝癌组织及癌旁组织中的表达水平

2.2肝癌组织中miR-7-5p及UbcH10表达水平与病理特征的相关性 以miR-7-5p>0.474为高表达，反之为低表达；以肝癌组织中UbcH10>0.711为高表达，反之则为低表达。分析57例肝癌患者性别、年龄、肿瘤最大径、TNM分期、分化程度、包膜形成、门静脉侵犯、HBsAg等病理特征与该两种生物标记物的相关性。结果显示，miR-7-5p表达水平与分化程度、包膜形成、门静脉侵犯等特征相关(P<0.05);UbcH10相对表达与肿瘤最大径、分化程度、TNM分期、门静脉侵犯相关(P<0.05)，见表2。

表2 UbcH10及miR-7-5p表达水平与肝癌病理特征的相关性[n(%)]

续表2 UbcH10及miR-7-5p表达水平与肝癌病理特征的相关性[n(%)]

2.3miR-7-5p及UbcH10不同表达水平与患者生存率的关系

2.3.1癌组织中miR-7-5p表达水平与患者无进展生存率的关系 肝癌随访期无进展生存率为38.60%(22/57)，miR-7-5p高表达患者无进展生存率为88.89%(8/9)，无进展生存期34.5个月；miR-7-5p低表达患者无进展生存率为29.17%(14/48),无进展生存期26.7个月。两组随访期无进展生存率差异有统计学意义(χ2=12.390，P<0.001),见图2。

图2 癌组织中miR-7-5p表达水平与肝癌无进展生存率的关系

2.3.2癌组织中UbcH10表达水平与患者无复发生存率(RFS)的关系 UbcH10高表达患者RFS为52.50%(21/40)，无复发生存时间28.8个月；UbcH10低表达患者RFS为82.35%(14/17),无复发生存时间32.8个月。两组随访期RFS差异有统计学意义(χ2=4.196，P=0.041),见图3。

图3 癌组织中UbcH10表达水平与肝癌RFS的关系

3 讨 论

全球范围内每年新发现的肝癌患者人数约900万，其中尤以中老年人群发病率最高[8-9]。肝癌的发生和进展的分子机制尚未完全明确，多认为是一个由多种基因参与的多节段的病理过程，整个病理过程涉及多种原癌基因激活及抑癌基因的失活或作用衰减[10]。肝癌患者早期无特异性临床表现，中后期表现为肝区疼痛、腹胀、消瘦、进行性肝组织肥大等，部分患者会出现低热、上消化道出血现象，在肝癌组织破裂后会出现急腹症，亦有仅表现为转移灶的症状[11-12]。生物分子标志物是肿瘤发生、增殖过程中由癌细胞合成、释放或宿主对癌细胞的反应性物质，寻找高灵敏度和高特异度的分子标志物对肝癌早期诊断、靶向治疗及预后评估均有重要的意义。

MiR-7的基因序列在人类有3个不同的基因位点编码，其初级转录产物在细胞和种经核酸内切酶Ⅲ Drosha剪切变为前体miR-7，在经Exportin 5转运至细胞质中，再次剪切变为成熟的miRNA，再形成RNA诱导沉默复合体以靶向调节特定mRNA的基因表达[13]。近年来，研究者们对MiR-7与恶性肿瘤生物学关系的研究日益增多，发现其参与了肿瘤细胞增殖分化及凋亡等过程[13-14]。相关研究发现，miR-7能够经靶向激活表皮生长因子受体(EGFR)、胰岛素受体底物1(IRS1)等参与到直肠癌、乳腺癌的生长、侵袭及转移过程中。本研究结果显示，MiR-7-5p在肝癌组织及癌旁组织中表达水平有明显差异，提示其在肝癌中扮演重要角色。肝癌组织中MiR-7-5p表达显著下调，可能是MiR-7-5p可抑制IRS2、EGFR表达活化抑制癌细胞迁移、侵袭所致[15-16]。为了进一步确认PCR的结果，分析发现miR-7-5p的表达水平与分化程度、包膜形成、门静脉侵犯等特征密切相关(P<0.05)。而张晓红等[13]的研究表示，miR-7-5p在结直肠癌的表达水平也与肿瘤位置、TNM分期、分化程度及远处转移有关，出现差异的原因可能因为本试验纳入样本较少，miR-7-5p高表达的数量较少导致结果出现偏倚。

UbcH10基因属于人泛素偶联酶E2基因家族成员，细胞周期调控过程中UbcH10可于APC相互作用影响有丝分裂纺锤体装配检测点，起到驱动细胞周期的进展[17]。E2在泛素介导的蛋白质降解活动中的职能主要是经硫酯键连接E1活化酶的泛素和E2活性位点的半胱氨酸，形成Ub-E2中间体，再经E3连接酶转移泛素至靶蛋白，靶蛋白经泛素化后很容易被26s蛋白酶识别并快速降解[18]。泛素蛋白酶系统(UP-S)有多重生理调控能力，一旦系统运转失常则会引发诸如炎症反应、肿瘤等多种病理性变化[19]。UbcH10作为肿瘤相关性泛素结合酶，已被证实参与到了脑胶质瘤、非小细胞肺癌等发生和进展中[7,20]。最近有研究发现，UbcH10高表达会促使APC/C过早降解cyclin B等细胞周期蛋白，增加了细胞染色体组的不稳定性，而该种状态与恶性肿瘤的发生于进展生理变化高度吻合[21]。HAN等[20]的试验表明，NSCLC细胞UbcH10调节各种S-烯丙基巯基半胱氨酸(SAC)成分过早降解，促使SAC功能障碍加剧，促进肿瘤细胞的增殖，在UbcH10表达质粒后癌细胞增殖及侵袭能力显著增强，而在细胞内转染干扰质粒以沉默UbcH10表达后，细胞侵袭力下降，凋亡速率加快，提示UbcH10 参与了恶性肿瘤的发生、侵袭转移过程。本研究结果显示，UbcH10在肝癌组织及癌旁组织中表达水平有明显差异，进一步分析发现肝癌组织UbcH10的表达水平与肿瘤最大径、分化程度、TNM分期、门静脉侵犯相关(P<0.05)，与以往相关研究[6,7，20]结果一致。

肝癌肿瘤最大径、组织分化程度、TNM分期及门静脉侵犯等病理特征与肿瘤进展速度、恶性程度和远处转移等关系密切，是肝癌患者预后质量的独立危险因素[22-23]。由此说明，miR-7-5p及UbcH10在肝癌组织中的异常表达与癌灶的恶性生物学特性相关联，均有其重要的病理学价值。通过Kaplan Meier生存分析显示，miR-7-5p高表达及UbcH10低表达患者随访期FRS明显较高，提示肝癌组织中miR-7-5p高表达及UbcH10低表达的患者预后质量更好。原因在于miR-7-5p的高表达能够降低IRS2、EGFR基因的活性从而阻断了癌细胞分化、增殖及转移的路径；同理，UbcH10低表达患者体内UP-S不会被识别和降解，充分发挥其多重生理调控职能，减缓了癌灶的进展过程，改善患者的预后状况。

综上所述，miR-7-5p及UbcH10在肝癌组织中呈异常表达，两者均与肿瘤的进展速度、恶性程度及远处转移密切相关，并且对患者复发有较高的预测价值，可以作为肝癌早期诊断、预后评估的潜在分子标志物和治疗靶点。但是对于该两种物质的作用途径、分子机制还应该进行深入研究。