青蒿抑制烟曲霉和黄曲霉的实验研究

毛丽旦·热合木吐拉 阿地拉·艾斯卡尔 汪建平

华中科技大学同济药学院，湖北 武汉 430030

病原性真菌时常出现在大众的视线里，它们以潮湿的地方为生存环境，在适宜条件下大量繁殖，严重威胁着人类的健康。据全球真菌感染行动基金会(GAFFI)统计，每年约有3亿人感染真菌，其中约135万人死亡[1]。环境病原真菌对人类健康威胁巨大，由于致死率高、治疗药物有限、自然界分布广泛且流行病学特点不清等原因，对其防控十分困难[2]。因此，切断其传播途径在感染控制方面意义重大。目前,医院和其他公共场所如高校、社区等,常采用紫外线进行空气消毒,存在消毒时间维持不长且不适合在有人环境下作业等问题,且化学消毒制剂具有腐蚀性、刺激性等缺陷,喷洒后易对人体和医疗设备造成损害[3]。反观天然药物，其来源丰富、成本低廉，在杀菌过程中不会造成二次污染，且气味芳香、高效安全，适合作为空气和环境消毒产品研发。

青蒿为菊科植物黄花蒿ArtemisiaannuaL.的干燥地上部分，秋季花盛开时采割，除去老茎，阴干[4-6]。其味苦、辛，性寒，归肝、胆经，具有“ 清虚热，除骨蒸，解暑热，截疟，退黄”的功效，用于温邪伤阴、夜热早凉、阴虚发热、骨蒸劳热、暑邪发热、疟疾寒热、湿热黄疸[6]。

青蒿化学成分多样，包括倍半萜、二萜、黄酮、苯丙酸、香豆素和挥发油等类成分[7-8]。其中倍半萜类既是青蒿的主要成分也是重要的有效部位，药理作用丰富，如解热、抗炎、抗病原微生物、抗哮喘、抗氧化、抗肿瘤等[8]。

本实验以中药青蒿为原料，通过抑制烟曲霉(Aspergillusfumigatus)和黄曲霉(Aspergillusflavus)的实验研究，为其抑制真菌的临床应用提供参考。

1 材料与试剂

青蒿(ArtemisiaannuaL.)，购自安徽毫州(批号： 20200916)，由本实验室汪建平教授鉴定；受试真菌烟曲霉(Aspergillusfumigatus)和黄曲霉(Aspergillusflavus)由本室从环境中分离。

2 方法

2.1 真菌的鉴定 固体培养基上培养真菌;取新鲜真菌,利用微波法提取真菌DNA;利用ITS1和ITS4引物PCR扩增真菌核糖体间区DNA片段;PCR片段回收后序列测定;利用NCBI的Blast对所得的序列进行比对。

2.2 提取物与供试液的制备 取青蒿50 g，于体积分数为80%的乙醇溶液1000 mL浸没后，回流提取，用时1.5 h。提取液过滤、待旋转蒸发仪挥发掉大部分溶剂后，得深褐色浓稠液50 mL，贮藏于阴凉处。

以青蒿提取物浓度(V青蒿/V乙醇)为5%、10%、15%和20%，乙醇体积分数为10%、20%和30% 配置12组供试液。

2.3 体外抑菌活性研究

2.3.1 接种 将供试菌用接种环挑取，分别接种于20个普通琼脂培养基上，置于霉菌培养箱中培养，观察并记录菌落生长情况。

2.3.2 抑菌效力测定 在无菌条件下将圆形滤纸用配置好的供试液润湿，以乙醇体积分数为单一变量将已经被供试液润湿的滤纸片平放在平板上，使其形成透明的抑菌圈，滤纸片周围有抑菌圈者为阳性，无抑菌圈者则为阴性。根据抑菌圈的大小可判断相应浓度提取液抑菌作用的强弱，同时进行两组平行实验，以确定结果的一致性。在同一霉菌培养箱内恒温培养48 h，每12 h观察结果并记录。

3 结果与结论

3.1 受试菌的鉴定

烟曲霉(Aspergillusfumigatus)检测序列：

利用NCBI的Blast进行序列比对，相似度为98%，鉴定为烟曲霉(Aspergillusfumigatus)。

黄曲霉(Aspergillusflavus)检测序列：

利用NCBI的Blast进行序列比对，相似度为99%，鉴定为黄曲霉(Aspergillusflavus)。

3.2 抑菌效果观察 乙醇体积分数为10%的一组没有出现菌丝的繁殖现象。由此确定体积分数为10%的乙醇作溶剂效果较好。比较不同浓度提取液抑菌情况，进一步观察到提取液浓度为15%和20%的滤纸片周边无菌丝，推断该浓度下的提取液渗透效果较好。

具体的侵染情况见表1、表2。

表1 烟曲霉(Aspergillus fumigatus)实验组中各溶液的侵染情况

表2 黄曲霉(Aspergillus flavus)实验组中各溶液的侵染情况

3.3 验证 以提取液浓度为15%、20%、25%和30%，乙醇体积分数为10%配置4组供试液。同法进行三组平行实验以确定最佳提取物浓度。观察到提取液浓度为15%和20%的滤纸片周边无菌丝。

3.4 确定处方 由实验结果知，乙醇体积分数为10%，提取液浓度为15%和20%时，抑制真菌繁殖的能力明显优于其他组。考虑到提取成本，确定处方为乙醇体积分数为10%，青蒿提取液浓度为15%。

图1 青蒿提取液对烟曲霉(左)和黄曲霉(右)的抑制

3.5 灌装 将配置好的药液等量装入一定规格的喷瓶。喷出的液滴大小均匀、在空气中分散效果较好，因此，不必加入表面活性剂或助推剂，即可制备成抑制真菌的青蒿喷雾剂。

3.6 青蒿提取液的化学成分预实验 取青蒿提取液，分别进行化学成分的初步检识。

3.6.1 盐酸镁粉反应 取青蒿提取液，加入少许镁粉振摇,再滴加几滴浓盐酸,1～2 min，显紫红色。

3.6.2 异羟肟酸铁反应 取样品液1 mL，加新鲜的1 moL/L盐酸羟胺甲醇液0.5 mL、6 mL/L氢氧化钾甲醇液0.2 mL，加热至沸，冷后加5%盐酸酸化，最后加1%三氯化铁溶液1～2滴，显紫红色。样品液在365 nm紫外灯下显荧光。

3.6.3 醋酐-浓硫酸显色反应 取样品少量于试管内，用醋酐溶解，进行醋酐-浓硫酸显色反应，溶液最终呈红色。

综上，可初步判断青蒿提取液中含萜类、黄酮类、香豆素类化学成分。

4 讨论

本实验采用的烟曲霉(A.fumigatus)和黄曲霉(A.flavus), 属腐生真菌[9]，为人类常见病原性真菌。全球因血液系统疾病、遗传免疫缺陷或实体器官移植等相关免疫抑制所致的侵袭性曲霉菌病(invasive aspergillosis, IA)已超过200 000例/年[9-10]。霉菌的繁殖能力强，且方式多样，无性或有性孢子作为其繁殖体具有小、轻、干、多、休眠期长和抗逆性强等特点，这些特点有助于烟曲霉(A.fumigatus)和黄曲霉(A.flavus)在自然界中随处散播和繁殖，因此切断其传播至关重要[11-12]。

在提取方面，考虑到乙醚的毒性和易燃性，选择了乙醇作溶剂。本实验中，乙醇既作为提取溶剂，也作为喷雾分散剂；乙醇本身有抑菌效果，但本实验发现，10%的乙醇，效果更好，说明青蒿提取物能起到真菌抑制作用。

据文献报道，青蒿主要含有黄酮类化合物(如芦丁rutin、雪梨苷cynaroside、异鼠李苷isorhamnetin等)[13]、香豆素类化合物(如东莨菪苷scopolin、东莨菪素scopoletin等)和倍半萜类化合物(如青蒿素artemisinin、双氢青蒿酸dihydroartemisinic acid、青蒿酸artemisinic acid等)[14]。本实验提取的青蒿提取液化学成分初步检识试验表明，提取液也含萜类、黄酮类、香豆素等。

本实验以青蒿为原料，以乙醇提取的有效部位，具有显著的抑制真菌烟曲霉(A.fumigatus)和黄曲霉(A.flavus)繁殖的作用。本实验结果可为青蒿抑制真菌的临床应用提供参考。