杞明眼保胶囊质量标准提升研究

刘文炜 龙天敏 白维薇

1.贵州中医药大学第一附属医院，贵州 贵阳 550001；2.贵州省人民医院，贵州 贵阳 550002

杞明眼保胶囊由丹参、墨旱莲、决明子等十五味中药制成，内容物为黄棕色的粉末，味微苦。具有清肝养肝、滋肾明目的功效，能促进视网膜的修复，对近视[1]、视疲劳、眼底血管病变、眼底视网膜病变有很好的疗效[2]。对其质量标准进行提升，使得用药安全、有效。在中医学理论中，人体是一个有机的整体，无论在结构上还是在功能上，机体内部脏腑与形体官窍之间，都是相互联系且不可分割的[3-4]。《诸病源候论》曰 ： “ 劳伤脏腑，肝气不足，兼受风邪，是精华之气衰弱，故不能远视。”《审视瑶函》曰： “ 肝经不足肾经病，光华咫尺视模糊。” 肝肾两虚，或过用目力，耗气伤血均可致目中神光不能发越于远处，故见近视。

杞明眼保胶囊中的墨旱莲属于补虚药[5]。临床用于肝肾阴虚，牙齿松动，虚发早白，眩晕耳鸣[6]。中医中辨证论治，近视属于肝肾两亏证，可滋补肝肾以治疗，墨旱莲主入肝肾，善能滋补肝肾之阴，可与女贞子同用[7]。女贞子(补虚药)，甘、苦、凉，归肝、肾经，具补肝肾阴、退虚热、明目的功效,用于肝肾阴虚证、阴虚内热证、目疾。女贞子中的大量成分属于三萜类，其中含量最高的是齐墩果酸，市场上齐墩果酸的主要来源也来自于女贞子[8]。丹参属活血化瘀药，苦、微寒，归心、肝经，有活血祛瘀、凉血消痈、除烦安神、调经止带[9]的功效,用于瘀血证、疮疡痈肿、热入营血心烦不眠。

1 仪器与材料

1.1 仪器 JY20002天平(上海良平仪器仪表有限公司)，2F-2三用紫外分析仪(上海市安亭电子仪器厂)，KQ-500DE超声仪(昆山市超声仪器有限公司)，Waters E 2695 高效液相色谱仪(美国waters公司)，MS105DU十万分之一分析天平(梅特勒托利多仪器上海有限公司)。

1.2 材料 石油醚(60～90 ℃)、乙酸乙酯、甲酸、氯仿、苯、正己烷、丙酮皆为国产分析纯；丹酚酸B对照品(批号： 111562-200504)，乙腈(色谱纯)。

2 方法与结果

2.1 墨旱莲药材的TLC鉴别 取3个批次的杞明眼保宝胶囊内容物，研细，各取5 g，加甲醇30 mL超声(功率140 w，频率42 KHz )处理30 min，放冷，过滤，滤液水浴挥干，残渣加0.1%盐酸溶液2 mL超声使溶解完全，转移至具塞试管中，加1 mL乙酸乙酯充分振摇，静至分层，取乙酸乙酯层为供试品。另取缺墨旱莲阴性样品，照供试品制备方法即得缺墨旱莲阴性样品。另取墨旱莲对照药材0.3 g于具塞试管，加甲醇1 mL超声处理30 min，上清液即为对照药材溶液。按照2015 年版《中国药典》(四部)中 TLC 法[9]，吸取上述溶液 5～8μL，分别点于同一硅胶 G 薄层板上，以展开剂氯仿∶丙酮∶乙酸乙酯∶甲酸(10∶2∶2∶0.5),展开，取出，晾干，于紫外灯365 nm下检视，供试品和墨旱莲对照药材相应位置处显相同的荧光斑点，且阴性样品无干扰。如图1所示。

1.缺墨旱莲阴性；2.杞明眼保胶囊供试品(20181101)；3.杞明眼保胶囊供试品(20181102)；4.杞明眼保胶囊供试品(20181103)；5.墨旱莲对照药材图1 墨旱莲TLC图谱

2.2 丹参药材的TLC鉴别 取3个批次的杞明眼保宝胶囊内容物，研细，各取1 g，加甲醇30 mL超声(功率140 w，频率42 KHz )处理30 min，放冷，过滤，滤液水浴挥干，残渣加0.1%盐酸溶液2 mL超声使溶解完全，转移至具塞试管中，加1 mL乙酸乙酯充分振摇，静至分层，取乙酸乙酯层为供试品。另取缺丹参阴性样品，照供试品制备方法即得缺丹参阴性样品。另取丹参对照药材0.1 g于具塞试管，加甲醇1 mL超声处理30 min，上清液即为对照药材溶液。以展开剂氯仿∶丙酮∶乙酸乙酯∶甲酸(10∶7∶5∶1),展开，取出，晾干，于氨蒸汽缸中显色5 min，立即紫外灯365 nm检视，供试品和对照药材相应位置处显相同的荧光斑点，且阴性样品无干扰。如图2所示。

注： 1.缺丹参阴性；2.杞明眼保胶囊供试品(20181101)；3.杞明眼保胶囊供试品(20181102)；4.杞明眼保胶囊供试品(20181103)；5.丹参对照药材图2 丹参TLC图谱

2.3 丹参药材中丹酚酸B的含量测定

2.3.1 色谱条件 色谱柱： Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相： 0.03 moL/L磷酸二氢钾-乙腈(70∶30)；流速： 1.0 mL·min-1，检测波长： 364 nm，柱温： 20 ℃，进样量20 μL。

2.3.2 对照品溶液的制备 称取丹酚酸B对照品适量，置于10 mL量瓶中，加甲醇-水(8∶2)溶液溶解并定容至刻度，制成748 μg/mL溶液，精密吸取1 mL于5 mL量瓶内，加甲醇-水(8∶2)定容至刻度，即得149.6 μg/mL的对照品溶液。分别制备不同浓度的丹酚酸B对照品溶液37.4 μg/mL、4.8 μg/mL、149.6 μg/mL、299.2 μg/mL、374.0 μg/mL。

2.3.3 供试品溶液的制备 取杞明眼保胶囊内容物，研细，取约0.2 g，精密称定，置具塞瓶内，精密加入甲醇-水(8∶2)溶液20 mL，称定重量，超声(功率140 w，频率42 KHz)30 min，放冷，再称定重量，用甲醇-水(8∶2)补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，即得供试品溶液。

2.3.4 阴性样品溶液的制备 取处方量的1/10，按照杞明眼保胶囊处方工艺，制备缺丹参药材的阴性样品，再按照“ 2.3.3”项下方法制成阴性样品溶液。

2.3.5 专属性考察 分别取对照品溶液(149.6 μg/mL)、供试品溶液(批号： 20181101)和阴性样品溶液，按照“ 2.3.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果，阴性样品对丹酚酸B的含量测定无干扰，理论板数按丹酚酸B峰计不低于3000。如图3所示。

图3 高效液相色谱图

2.3.6 线性关系考察 精密吸取“ 2.3.2”项下的系列对照品溶液，按照“ 2.3.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。各样品平行进样2次。以峰面积的平均值为纵坐标(y)、进样量为横坐标(x，ng)进行回归分析，得回归方程为y=4945.8x- 39483。结果显示，丹酚酸B检测进样量的线性范围为37.4～374.0 μg/mL，相关系数r=0.9999。

2.3.7 精密度试验 分别精密吸取质量浓度为149.6 μg/mL的对照品溶液，按照“ 2.3.1”项下色谱条件重复测定峰面积6次。结果，峰面积的 RSD为0.55%(n=6)，表明仪器的精密度良好。

2.3.8 重复性试验 精密称取杞明眼保胶囊0.2g(批号： 20181101)，共 6 份，按照“ 2.3.3”项下方法制成供试品溶液，再按照“ 2.3.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并按标准曲线法计算含量。结果，丹酚酸B的平均含量为 3.6690mg/g，RSD 为 1.17%(n=6)，表明该方法的重复性良好。

2.3.9 稳定性试验 取“ 2.3.8”项下的供试品溶液(批号： 20181101)，分别于室温下放置 0 h、2 h、4 h、6 h、8 h时按照“ 2.3.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，丹酚酸B峰面积的RSD为0.46%(n=5)，表明该溶液在8 h内稳定性良好。

2.3.10 加样回收率试验 精密称取杞明眼保胶囊粉末0.2 g(批号： 20181101)，共6份，置于具塞锥形瓶中，分别精密加入丹酚酸B对照品(90.3 μg/mL)25 mL，然后按照“ 2.3.3”项下方法制成供试品溶液，再按照“ 2.3.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率。结果见表1。

表1 加样回收率试验结果

2.3.11 含量限度 精密称取批号为20181101-20181110的杞明眼保胶囊0.2g，共20份(每个批次2份)，按照“ 2.3.3”项下方法制成供试品溶液，再按照“ 2.3.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并按标准曲线法计算含量。再按照2015年版药典丹参药材项下丹酚酸B的含量测定方法，测定丹参药材的含量，计算平均转移率为44.73%，得出杞明眼保胶囊中丹酚酸B含量限度为4.3452 mg/g，即每粒(一个处方量制成1000粒胶囊，0.4 g/粒，)含丹参以丹酚酸B(C36H30O16)计不得少于1.74 mg。

3 讨论

3.1 TLC鉴别条件的选择 提取方法的选择： 选用过甲醇、乙醇、乙酸乙酯为溶剂直接进行提取，斑点复杂，无法分离，最后采用醇提，再用水溶后萃取的方式，斑点清晰，杂质较少。

展开剂的选择： 曾选用苯-正己烷-石油醚(60-90 ℃)-乙酸乙酯-甲酸=2.5∶2.5∶1∶3.5∶1，苯-正己烷-石油醚(60-90 ℃)-乙酸乙酯-甲酸=2.5∶2.5∶1∶3.5∶1，氯仿-丙酮-乙酸乙酯-甲酸=10∶2∶2∶0.5等展开剂，最终确定墨旱莲开展剂为氯仿-丙酮-乙酸乙酯-甲酸=10∶2∶2∶0.5，丹参展开剂为氯仿-丙酮-乙酸乙酯-甲酸=10∶7∶5∶1。

3.2 丹酚酸B的限度确定 丹参中丹酚酸B是水溶性成分[10]，按2015版《中国药典》规定，干燥丹参中丹酚酸B的含量不得少于3.0%。丹酚酸B为一分子咖啡酸与三分子丹参素缩合而成，是丹参中含量最高的酚酸类成分[11]，有抗脂质过氧化、消除自由基和抗血栓的作用[12]。本品采用药典条件进行丹酚酸B的含量测定条件。

分别收集了10个不同产地和批次的丹参药材，分别按照工艺方法制备成10个批次的杞明眼保胶囊，在测定含量，计算平均转移率，在初步计算含量限度，后期会进一步探索研究更多批次样品的含量测定，从而保证限度制定的合理性。

本研究成功建立了杞明眼保胶囊中墨旱莲、丹参药材的鉴别方法和丹参药材中丹酚酸B的含量测定方法。该品含丹参以丹酚酸B(C36H30O16)计不得少于1.74 mg/粒。

本研究建立了杞明眼保胶囊中丹参、墨旱莲的TLC鉴别方法，并对所建方法进行了较全面的方法学考察，同时也对杞明眼保胶囊中丹酚酸B的含量测定进行了研究，为本品的质量标准提升提供了依据，有利于本品的质量控制。