早发冠心病患者载脂蛋白E基因多态性分析及其与冠状动脉病变严重程度关系研究

许 璐，白春英，陈士萍，韩旭晨

(1.锦州医科大学，辽宁 锦州 121001；2.赤峰学院附属医院心血管内科，内蒙古 赤峰 024000；3.赤峰学院内蒙古人类遗传病研究重点实验室，内蒙古 赤峰 024000)

早发冠心病(Premature coronary artery disease，PCAD)是一种特殊的冠心病类型，指男性在55岁前、女性在65岁前发病。研究[1]显示，冠心病虽更易出现在老年人中，但目前PCAD发病率呈逐年上升趋势，冠心病发病年龄也有提早的趋势。PCAD是由各种原因引起冠状动脉粥样硬化，当血管管腔狭窄达到一定程度后引起心脏供血不足，心肌缺血、缺氧。相关研究[2]显示，血脂异常与PCAD的发生有关。高密度脂蛋白降低或低密度脂蛋白升高可影响脂质转运及其抗动脉粥样硬化作用，可增加PCAD发生的危险性。有报道[3]指出，人类载脂蛋白E(Apolipoprotein E，ApoE)基因与冠心病的发生存在密切关联。ApoE基因可作为脂蛋白结构和功能蛋白，对血脂代谢起到主要作用[4]。基于此，本研究探究PCAD患者ApoE基因多态性并分析其与冠状动脉病变严重程度的关系，为该疾病的临床评估提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 以2020年1月至2021年4月于我院心血管内科就诊的冠心病患者279例为研究对象。根据发病年龄将其分为早发组(男性发病年龄≤55岁或女性发病年龄≤65岁，91例)和迟发组(男性发病年龄>55岁或女性发病年龄>65岁，188例)。两组患者除年龄外，病程、体重指数等比较差异无统计学意义(均P>0.05)，见表1。病例纳入标准：符合冠心病诊断标准[5]；临床资料完整。排除标准：合并先天性心脏病、心肌病或充血性心力衰竭；合并严重肝、肾功能不全；合并恶性肿瘤；合并严重急性感染性疾病；合并结缔组织疾病。本研究经医院伦理委员会审核批准，且患者均已签署知情同意书。

表1 早发组与迟发组患者一般资料比较

1.2 研究方法

1.2.1 ApoE基因多态性分析：采集患者空腹静脉血3 ml于含EDTA的抗凝剂采血管中，应用Eppendorf公司Centrifuge 5804R型高速离心机以1500 r/min离心5 min，去除上清液后将剩余物加入至0.2%氯化钠溶液10 ml中混匀，在室温下以2500 r/min离心5 min，分离底层白细胞。应用凯普生物公司的DNA提取试剂盒提取基因组DNA后，应用Thermo公司ABI7500型实时荧光定量PCR仪对样本中DNA进行扩增处理，引物序列(正向5’-TAAGCTTGGCACGGCTGTCAAGGA-3’；反向5’-AGAATTCGCCCCGGCCTGGTACAC-3’)由上海生工生物工程有限公司合成，扩增条件：37 ℃条件下尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)处理10 min，95 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火60 s，共40个循环。取10 μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(0.2%溴酚蓝、30%甘油)处理，采用竖式电泳槽电泳，在50 mV恒压下电泳1～1.5 h，至溴酚蓝接近玻板底部2 cm时终止电泳。将电泳后的PAGE凝胶置于0.5 μg/ml溴乙锭中染色10 min，经特异性限制内切酶消化后得到6种基因型(E2/E2、E2/E3、E3/E3、E2/E4、E3/E4、E4/E4)，在Beckman公司Du-640型紫外分光光度仪下观察结果。

1.2.2 冠状动脉病变程度评估：参考文献[6]以Gensini积分评估冠状动脉病变并对早发组患者进行分组。Gensini积分<7分者纳入轻度组(39例)，7～14分者纳入中度组(29例)，>14分者纳入重度组(23例)。

1.3 观察指标 ①比较早发组及迟发组的ApoE基因多态性，分析其与PCAD发生的关系；②比较轻度组、中度组、重度组患者的ApoE基因多态性，分析其对PCAD患者冠状动脉病变严重程度的评估价值。

2 结 果

2.1 早发组与迟发组患者ApoE基因多态性分析 见表2。早发组ApoE基因E3/E3型检出率高于迟发组(P<0.05)。两组ApoE基因E2/E2、E2/E3、E2/E4、E3/E4及E4/E4检出率比较差异无统计学意义(均P>0.05)。

表2 早发组与迟发组患者ApoE基因多态性分析[例(%)]

2.2 ApoE基因多态性与PCAD发生关系的Logistic分析 见表3。Logistic回归分析显示，ApoE基因E3/E3型是影响PCAD发生的危险因素(P<0.05)。

表3 ApoE基因多态性与PCAD发生关系的Logistic回归分析

2.3 不同冠状动脉病变严重程度患者ApoE基因多态性分析 见表4。PCAD患者ApoE基因E3/E4型检出率随冠状动脉病变严重程度的加重而升高(P<0.05)。

表4 不同冠状动脉病变严重程度患者ApoE基因多态性分析

2.4 ApoE基因多态性对PCAD患者冠状动脉病变严重程度的评估价值 见表5。ROC曲线分析显示，ApoE基因E2/E3、E3/E3和E3/E4型对PCAD患者冠状动脉病变严重程度具有一定的评估价值，且各基因型联合评估的曲线下面积(AUC)更高(均P<0.05)。

表5 ApoE基因多态性对PCAD患者冠状动脉病变严重程度的评估价值

3 讨 论

近年来，冠心病的发病日益年轻化，患者在患病后易丧失劳动力，造成了巨大的社会经济损失[7]。临床资料[8]显示，PCAD患者多存在脂质代谢紊乱。研究[9]发现，PCAD患者与迟发性冠心病的高密度脂蛋白及甘油三酯水平均存在差异，表明早发性及迟发性冠心病的血脂代谢存在差异。冠心病是一种多种内在遗传因子和外在环境相互作用导致的疾病。

相关报道[10]指出，ApoE基因可通过诱发血脂代谢异常而导致冠心病的发生。ApoE是一种多态性蛋白，主要分布于乳糜微粒、低密度脂蛋白等表面，通过与低密度脂蛋白受体结合调节体内的血脂水平，从而影响冠状动脉粥样硬化程度及冠心病的发病率[11]。ApoE基因位于19号染色体长臂，属于常染色体显性遗传基因，含有3种等位基因，其不同基因与受体的结合活性有较大差异，从而对血脂、脂蛋白代谢产生较大的影响。亦有报道[12-13]发现，ApoE基因多态性可决定血脂水平，从而影响动脉粥样硬化病变的发生与发展。本研究发现，早发组ApoE基因E3/E3型检出率高于迟发组，提示ApoE基因E3/E3型或与冠心病发生时间有关。本研究进一步分析发现，ApoE基因E3/E3型是影响PCAD发生的危险因素，提示ApoE基因E3/E3型或可诱导PCAD的发生，这可能与E3/E3型可加重机体血脂代谢异常、促进动脉粥样硬化进展有关。但有研究[14]指出，PCAD患者ApoE基因E4等位基因与迟发性冠心病患者相比明显增高，与本研究结果不符，这可能与本研究样本量较少有关，故后期需增加样本量以进一步分析。

血脂异常是动脉粥样硬化进展的重要因素，而动脉粥样硬化是冠心病发生的病理基础，故目前认为血脂代谢与冠心病的发生密切相关[15]。ApoE是一种由星形胶质细胞产生、神经元和小神经胶质细胞参与合成的中枢神经系统重要载脂蛋白[16]。目前，对于ApoE基因与冠状动脉病变程度的关系尚存在争议。有报道[17-18]发现，ApoE基因多态性因与血脂代谢有关，或与冠状动脉病变也存在密切关联。但有研究[19-20]指出，ApoE基因多态性与冠心病患者冠状动脉受累数目无关。因此，本研究进行了相关研究，发现PCAD患者ApoE基因E3/E4型检出率随冠状动脉病变严重程度的加重而升高，表明患者ApoE基因多态性与冠状动脉病变严重程度相关，这主要是因为ApoE基因多态性可导致血脂异常，抑制内皮一氧化氮合酶活性，改变血管内皮功能，从而加重冠状动脉病变程度。本研究结果显示，ApoE基因E2/E3、E3/E3和E3/E4型对PCAD患者冠状动脉病变严重程度具有一定的评估价值，且各基因型联合评估的AUC更高，因此ApoE基因多态性分析对PCAD患者冠状动脉病变严重程度具有较好的评估价值。

综上所述，PCAD患者ApoE基因以E3/E3型为主，E3/E4型或与冠状动脉病变严重程度有关，且ApoE基因多态性分析对PCAD患者冠状动脉病变严重程度具有较好的评估价值。