巨大戟醇甲基丁烯酸酯有关物质的合成

李彦赟，杨 昱，孙传腾，吴 潇

（天津市中药质量控制企业重点实验室，天津中新药业研究院有限公司，天津 300457）

巨大戟醇甲基丁烯酸酯（ingenol mebutate，ingenol-3-angelate，巨大戟醇-3-当归酸酯，1）是从南欧大戟中分离得到的二萜类化合物，由丹麦利奥制药开发为治疗日光性角化病的外用凝胶剂，商品名为Picato®，2012年获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准上市［1］，随后在欧洲、澳大利亚、加拿大、韩国等30多个国家和地区上市。药理研究表明，巨大戟醇甲基丁烯酸酯通过化疗作用及免疫治疗作用的双重机制发挥治疗日光性角化病的作用［2］：一方面迅速诱导畸变的角质细胞坏死，另一方面诱导定向病损区的免疫应答，通过嗜中性粒细胞介导的抗体依赖的细胞毒作用（ADCC）进一步杀死异常细胞，因而可以在较短的治疗周期中起到杀伤畸变细胞的作用。与其他用于治疗日光性角化病的皮肤外用制剂（咪喹莫特、双氯芬酸钠等）相比，巨大戟醇甲基丁烯酸酯仅需用药2~3 d即可，具有用药周期短、患者依从性好的特点［3-4］。因其独特的作用机制和显著的临床疗效，入选国家药品审评中心（CDE）《首批专利权到期、终止、无效且尚无仿制申请的药品清单》且居于首位。大量临床试验及案例报道显示，巨大戟醇甲基丁烯酸酯对基底细胞癌、跖疣、尖锐湿疣、鲍恩病、黑色素瘤等与人乳头状瘤病毒（HPV）感染、紫外线损伤相关的皮肤病具有良好改善作用，为近年来皮肤病研究领域的热门药物之一［5-9］。

本文以巨大戟醇为起始物料，对巨大戟醇甲基丁烯酸酯的2个主要有关物质进行合成，为其原料药与制剂的质量控制提供对照品合成方法。

1 杂质来源及合成路线

巨大戟醇甲基丁烯酸酯为巨大戟醇的3位羟基当归酰化形成的酯（3-O-当归酰基巨大戟醇），由于巨大戟醇结构中4位、5位及20位均有游离羟基，故在贮存过程中会生成酯交换产物，酯交换产物5-O-当归酰基巨大戟醇（2，杂质A，巨大戟醇-5-当归酸酯）、20-O-当归酰基巨大戟醇（3，杂质B，巨大戟醇-20-当归酸酯）含量也是原料药及凝胶剂的关键质量控制指标（结构见图1），原研药巨大戟醇甲基丁烯酸酯凝胶剂通过添加缓冲液控制pH值及低温冷藏保存的方式控制两种酯交换产物的生成［10-11］。

图1 巨大戟醇甲基丁烯酸酯及有关物质化学结构

杂质A和杂质B均无合成路线研究报道，市面上也没有杂质对照品销售。利奥制药生产巨大戟醇甲基丁烯酸酯凝胶剂所用的原料药为从南欧大戟（Euphorbia peplus）的地上部分分离纯化而获得［12］，其含量仅为0.000 11%。由于从南欧大戟中未分离到酯交换产物5-O-当归酰基巨大戟醇和20-O-当归酰基巨大戟醇，原研药的杂质相关研究是将原料药制备成溶液，经长时间放置后分离获得酯交换产物。该方法效率低，特定杂质的收率不受控。

巨大戟醇甲基丁烯酸酯的母核为经典的二萜类化合物巨大戟醇（ingenol），此类化合物多以羧酸酯的形式广泛存在于大戟属植物中，简单易得，其中千金子中含量高达0.07%，为市售巨大戟醇的主要来源［13］。本文以巨大戟醇为原料，利用选择性保护基团对3位、20位的羟基进行保护，将5位羟基当归酰化反应后再脱去保护基，合成杂质A。由于20位羟基的反应活性强于其他游离羟基，可利用低温反应在20位进行选择性酯化，合成杂质B。2种杂质的合成路线见图2和图3。

图2 5-O-当归酰基巨大戟醇（2，杂质A）的合成路线

图3 20-O-当归酰基巨大戟醇（3，杂质B）的合成路线

2 仪器与试剂

2.1 仪器Waters e2695高效液相色谱仪（美国沃特世科技有限公司）；Bruker AvanceⅡ400 MHz核磁共振仪（德国布鲁克公司）；BUCHI R-205旋转蒸发仪［步琦实验室设备贸易（上海）有限公司］；ACQUITY UPLC H-Class Quattro Micro API三重四级杆液质联用仪（美国沃特世科技有限公司）；METTLER TOLEDO MS105电子分析天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］。

2.2 试剂 巨大戟醇（含量：98%，南京春秋生物工程有限公司，批号JDJC21900102）；咪唑（批号LOA0Q79）、叔丁基二甲基氯硅烷（TBDMSCl，批号LB70Q66）、三乙基氯硅烷（TESCl，批号L160P47）购自北京百灵威科技有限公司；双三甲基硅基胺基锂（LiHMDS，批号SHBJ0605）购自sigma-aldrich公司；当归酸酐（批号GGB7K-UA）购自梯希爱（上海）化成工业发展有限公司（TCI）；其他常规试剂均采购自天津科密欧化学试剂有限公司。

3 合成方法

3.1 20 -O-叔丁基二甲基硅基巨大戟醇（20-OTBDMS-ingenol，中间体1）的合成 称取44.80 mg巨大戟醇（ingenol）至10 ml茄形瓶中，用2 ml无水二氯甲烷溶解，冰盐浴控制温度约-8℃，依次加入31.56 mg叔丁基二甲基氯硅烷（TBDMSCl）、32.00 mg咪唑，搅拌反应40 min，TLC检测［石油醚-丙酮（3∶1）］反应完全。加6 ml水搅拌，用相同体积的乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯层合并后减压浓缩至干，经快速硅胶柱色谱纯化，洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯（3∶1），得到53.60 mg无色固体，利用核磁共振波谱法确证结构为20-O-叔丁基二甲基硅基巨大戟醇（中间体1），收率为90%。

1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ:5.98（1H，brd，J=4.2 Hz），5.89（1H，d，J=1.2 Hz），4.49（1H，d，J=4.4 Hz），4.31（1H，d，J=4.4 Hz），4.25-4.10（3H，m），4.04（1H，s），3.84（1H，d，J=4.2 Hz），2.76（1H，d，J=4.6 Hz），2.49-2.40（1H，m），2.26-2.36（1H，m），1.84（3H，d，J=1.0 Hz），1.79-1.70（1H，m），1.66（1H，s），1.11（3H，s），1.05（3H，s），0.95（3H，d，J=7.2 Hz），0.88（9H，s），0.74-0.63（1H，m），0.07（6H，d，J=2.1 Hz）。13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ:206.8，139.5，138.4，129.4，127.6，84.5，80.7，76.3，72.3，68.2，43.9，39.5，31.0，28.6，25.9（3C），24.1，23.4，23.2，18.2，17.3，15.7，15.6，-5.1，-5.3。

3.2 3 -O-三乙基硅基-20-O-叔丁基二甲基硅基巨大戟醇（3-O-TES-20-O-TBDMS-ingenol，中间体2）的合成 向10 ml茄形瓶中依次加入45.20 mg中间体1和57.60 mg咪唑，用2 ml无水二氯甲烷溶解，加入88 μl三乙基氯硅烷（TESCl），室温搅拌反应40 min，TLC检测［（石油醚-丙酮（20∶1）］反应完全。加水6 ml搅拌，用相同体积的乙酸乙酯萃取3次，有机相合并后减压浓缩至干，经快速硅胶柱色谱纯化，洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯（20∶1），得到41.20 mg无色固体，利用核磁共振波谱法确证结构为3-O-三乙基硅基-20-O-叔丁基二甲基硅基巨大戟醇（中间体2），收率为73%。

1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ:5.98（1H，brd，J=3.0 Hz），5.88（1H，d，J=1.4 Hz），4.51（1H，s），4.24（1H，d，J=13.0 Hz），4.11（1H，d，J=13.0 Hz），4.08-4.01（1H，m），3.82（1H，d，J=1.0 Hz），3.68（1H，d，J=9.8 Hz），3.15（1H，d，J=9.8 Hz），2.44-2.32（1H，m），2.24-2.16（1H，m），1.80（3H，d，J=1.0 Hz），1.79-1.68（1H，m），1.13（3H，s），1.05（3H，s），0.98（9H，t，J=8.0 Hz），0.96-0.86（12H，m），0.79（7H，q，J=7.8 Hz），0.04（6H，d，J=5.6 Hz）。13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ:207.7，140.5，138.8，130.1，124.5，84.4，81.7，74.8，72.6，66.2，43.9，38.8，31.2，28.8，26.0（3C），23.8，23.7，23.4，18.4,17.7，16.1，15.7，6.9（3C），5.3（3C），-5.0，-5.2。

3.3 3 -O-三乙基硅基-5-O-当归酰基-20-O-叔丁基二甲基硅基巨大戟醇（3-O-TES-5-O-angeloyl-20-O-TBDMS-ingenol，中间体3）的合成 称取40.9 mg中间体2至10 ml茄形瓶中，用橡胶塞密封，用3 ml无水四氢呋喃溶解后，氩气保护条件下依次加入214 μl双三甲基硅基胺基锂（LiHMDS）和38 μl当归酸酐，冰盐浴（-10℃）低温搅拌1 h，TLC检测［石油醚-丙酮（20∶1）］反应完全。加水9 ml搅拌，用相同体积的乙醚萃取3次，有机相合并后减压浓缩至干，经快速硅胶柱色谱纯化，洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯（50∶1），得到31.3 mg无色固体，利用核磁共振波谱法确证结构为3-O-三乙基硅基-5-O-当归酰基-20-O-叔丁基二甲基硅基巨大戟醇（中间体3），收率为67%。

1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ:6.13（2H，brs），5.95（1H，s），5.42（1H，s），4.20（1H，d，J=11.4 Hz），3.97（1H，s），3.81（1H，d，J=3.3 Hz），2.53-2.40（1H，m），2.2 4-2.15（1H，m），2.01（3H，d，J=7.0 Hz），1.94（3H，s），1.79（3H，s），1.14（3H，s），1.06（3H，s），0.97-0.86（12H，m），0.84（9H，s），0.67-0.55（6H，m），-0.01（6H，d，J=4.3 Hz）。13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：207.6，166.9，139.8，138.9，138.1，130.4，127.6，124.6，85.2，80.9，74.1,73.1，64.8，43.9，38.3，31.3，28.8，26.1（3C），23.9，23.8，23.5，20.7，18.5，18.1，16.2，16.1，15.9，6.9（3C），5.2（3C），-5.2，-5.3。

3.4 5 -O-当归酰基巨大戟醇（杂质A）的合成 称取30.1 mg中间体3至10 ml茄形瓶中，用3 ml甲醇溶液溶解后，加入6 mol/L盐酸80 μl，室温搅拌反应45 min，TLC检测［石油醚-丙酮（3∶1）］反应完全。加水9 ml搅拌，用相同体积的乙醚萃取3次，有机相合并后减压浓缩至干，经快速硅胶柱色谱纯化，洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯（2∶1），得到10.3 mg无色固体，利用质谱及核磁共振波谱法确证结构为5-O-当归酰基巨大戟醇（杂质A），收率为52.4%，经HPLC检测纯度为99.19%［面积归一化法：色谱柱Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为水（A）-乙腈（B）；洗脱梯度（0~12 min，40% B；12~50 min，40%B→60%B）；流速1.0 ml/min；检测波长210 nm；柱温30℃；进样量10 μl；保留时间20.8 min］。

1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：6.18（1H，d，J=4.7 Hz），6.13（1H，d，J=7.2 Hz），5.81（1H，s），5.39（1H，s），4.36-4.28（1H，m），3.95（2H，q，J=12.8 Hz），3.88-3.75（2H，m），3.03（1H，d，J=5.6 Hz），2.53（1H，t，J=6.0 Hz），2.39（1H，brs），2.16（2H，s），1.99（3H，d，J=7.2 Hz），1.93（3H，s），1.81（3H，s），1.14（3H，s），1.04（3H，s），0.98（3H，d，J=6.6 Hz），0.70（1H，q，J=7.6 Hz）。13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ:207.5，168.1，139.9，139.6，138.6，129.3，128.3，127.2，85.5，79.3，75.3，74.0，65.3，44.0，38.4，31.9，28.7，24.1，23.7，23.5，20.7，18.4，16.0，15.7，15.1。ESI-MS m/z：475.3［M+HCOO］-，429.2［M-H］-。

3.5 20 -O-当归酰基巨大戟醇（杂质B）的合成 称取102.16 mg巨大戟醇（ingenol）至25 ml茄形瓶中，加入无水碳酸钠150.71 mg，依次加入5 ml无水乙腈、当归酸酐300 μl，冰盐浴控制温度约-8℃，搅拌反应24 h。加水15 ml搅拌，用相同体积的乙酸乙酯萃取3次，有机相合并后减压浓缩至干，经快速硅胶柱色谱纯化，洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯（2∶1），得到27.5 mg无色固体，利用质谱及核磁共振波谱法确证结构为20-O-当归酰基巨大戟醇（杂质B），收率为22%，经HPLC检测纯度为99.84%（面积归一化法，色谱条件同杂质A，保留时间25.0 min）。

1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：6.14-6.02（2H，m），5.93（1H，d，J=1.2 Hz），4.78（1H，d，J=13.0 Hz），4.61（1H，d，J=13.0 Hz），4.41（1H，s），4.18-4.05（2H，m），3.68（1H，d，J=10.0 Hz），3.12（1H，d，J=6.5 Hz），2.77（1H，brs），2.40-2.20（2H，m），1.93（3H，d，J=7.2 Hz），1.87（3H，s），1.83（3H，s），1.11（3H，s），1.06（3H，s），0.96（3H，d，J=7.2 Hz），0.69（1H，q，J=8.6 Hz）。13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ:206.7，168.3，138.9，138.3，137.0，130.1，128.4，127.9，84.5，80.8，74.0，72.7，66.3，44.2，39.9，31.1，28.6，24.1，23.3，23.2，20.7，17.4，15.9，15.6，15.5。ESI-MS m/z：475.2［M+HCOO］-，429.2［M-H］-。

4 讨论

药物合成工艺中引入的杂质、原料药降解产物等有关物质会对药品质量与疗效产生较大影响，毒性杂质甚至对人体健康有害或产生其他不良反应，因此，化学原料药及制剂中有关物质的研究与控制是确保用药安全有效的重要工作。本文首次报道了巨大戟醇甲基丁烯酸酯的2个酯交换产物5-O-当归酰基巨大戟醇和20-O-当归酰基巨大戟醇（杂质A和杂质B）的合成方法，利用核磁共振波谱（1H-NMR、13C-NMR）及质谱（MS）确证了杂质及中间体的结构；HPLC检测结果显示，经纯化后两个目标杂质的纯度其达到99%以上，可以作为巨大戟醇甲基丁烯酸酯原料药及凝胶剂有关物质研究的对照品。

杂质的合成起始物料选择了来源广泛、方便易得的经典二萜类天然产物巨大戟醇，其结构中共含有4个游离羟基，其中20位的伯醇羟基反应活性最强，3位及5位的仲醇羟基次之，4位叔醇羟基反应活性最弱，故20-O-当归酰基巨大戟醇（杂质B）可在低温条件下直接一步酰化反应获得，但由于选择性不高，会生成3-O-当归酰基巨大戟醇、3，20-O-二当归酰基巨大戟醇等副产物，杂质B的收率为22%。5-O-当归酰基巨大戟醇（杂质A）合成过程中则利用不同保护基依次对20位、3位的羟基进行了选择性保护，当归酰化反应后两种保护基可在酸性条件下同步脱去。

本文所述巨大戟醇甲基丁烯酸酯有关物质的合成方法简单易行，中间体及目标产物分离纯化简便，产物纯度高，为2种杂质的大量制备及巨大戟醇甲基丁烯酸酯产品的有关物质研究、质量标准研究和杂质限度控制奠定了基础。