细针穿刺细胞学联合BRAF（VE1）、CyclinD1表达在甲状腺结节诊断中的应用*

戴素娟 李俊韬 郭广秀 谢训禄

甲状腺结节属于临床常见且无特征性临床表现疾病，根据结节性质可分为良恶性，大多数结节为良性，恶性结节占5%～15%[1]。随着我国甲状腺癌发病数量不断提高，临床认为有必要加强甲状腺结节管理[2]。不同结节性质选择的治疗策略及预后也存在一定差异，因此临床认为早期精确诊断结节性质对治疗及预后尤为重要。目前，超声引导下细针穿刺细胞学检查（US-FNAB）属于甲状腺结节早期诊断重要及主要手段之一，具有较高敏感度与特异度，但对于部分微小结节其准确性仍有待提高。近年来有研究显示，细胞周期素D1（CyclinD1）蛋白过表达、V-Raf 鼠类肉瘤滤过性病毒致癌基因同源体B1（the oncogenic homologue B1 of the murine sarcoma-filtering toxin，BRAF）基因突变与甲状腺癌的发生、发展及预后存在密切相关性，而采用基因检测技术，对DNA 提取质量及设备要求较高，且成本昂贵，而采用免疫细胞化学染色技术，具有简单、快速、成本低、可操作性强等诸多优势[3-5]。基于此，本研究将采用免疫细胞化学方法检测BRAF V600E[BRAF（VE1）]和CyclinD1 蛋白表达，联合US-FNAB 对甲状腺结节进行诊断分析，旨在探讨其在甲状腺结节早期诊断中的应用价值，为临床治疗提供依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2019 年1 月-2020 年6 月赣州市人民医院就诊的200 例择期行切除手术的甲状腺结节患者，男74 例，女126 例；年龄21～74 岁，平均（46.32±12.18）岁；病灶直径3.0～23.0 mm，平均（11.25±3.47）mm。纳入标准：（1）均符合《甲状腺结节和分化型甲状腺癌诊治指南》，实性结节直径>1 cm 且同时具备形态不规则、边界不清等可疑恶性超声影像特征，符合甲状腺影像报告和数据系统（thyroid imaging reporting and data system，TI-RADS）4 类[6]；（2）符合文献[7]《超声引导下甲状腺结节细针穿刺活检专家共识及操作指南》US-FNAB 操作条件，且取材涂片满意。排除标准：（1）存在其他非甲状腺转移局部肿瘤；（2）既往有头颈部放射治疗或甲状腺癌家族史；（3）穿刺部位感染或无法配合诊断。本研究已经医院伦理委员会批准，患者及家属均知情同意并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 US-FNAB 仪器：日立二郎神彩超HI VISION Avius L，US-FNAB 操作：引导患者取仰卧位，头向后仰，颈部垫高，充分暴露穿刺部位。在常规超声检查甲状腺后对可疑病灶进行穿刺定位，找到最佳穿刺面，一般以甲状腺横切面进行穿刺，病灶位于外侧者需采用由颈中线向外侧穿刺，位于内侧者需采用颈外侧向内侧穿刺。常规消毒后，穿刺针（22G，巴光）于探头内缘在超声仪器实时引导下沿探头长轴进针，先迅速穿刺至甲状腺包膜上方，停顿调整后，显示针尖与病灶在同一切面上，再迅速进针穿刺至病灶内，清晰显示针尖在病灶区后，拔出针芯少许形成人工负压，然后在不同针道来回提插5～7 次后拔出穿刺针，用充满空气的5 mL注射器将细针内的细胞推注于APES 涂胶片上，涂片3～5 张，用于HE 染色，用有可疑恶性细胞的涂片进行免疫细胞化学染色。细胞学诊断标准：参照甲状腺细胞病理学Bethesda 分类法，Ⅰ类表示标本无法准确判断，Ⅱ类表示标本患者为良性病变，Ⅲ类表示标本患者为意义不明确的非典型病变，Ⅳ类表示标本患者为可疑或明确滤泡性肿瘤，Ⅴ类表示标本患者为可疑恶性肿瘤，Ⅵ类表示标本患者为恶性肿瘤，剔除Ⅰ类无诊断患者，其中Ⅳ类及以下（良性、未定性、可疑滤泡肿瘤）归入阴性，而Ⅴ类及以上归入阳性[8]。

1.2.2 免疫细胞化学染色 仪器：LUMATAS、PathCom 全自动免疫组化仪。具体操作如下：将细胞推注于APES 涂胶片上，涂片3～5 张，用于HE 染色，对HE 染色有可疑恶性细胞的涂片2 张进行免疫细胞化学染色检测。用钻石笔刻号后装入染色架并泡入二甲苯Ⅰ 10 min，去掉盖玻片，将涂片泡入二甲苯Ⅱ5 min，二甲苯Ⅲ 5 min，无水乙醇Ⅰ 3 min，无水乙醇Ⅱ 3 min，95%乙醇1 min，70%乙醇1 min，自来水稍洗，1%盐酸酒精脱色，镜下控制至切片几近无色，约需5 min，2%草酸水溶液浸润3～5 min，自来水稍洗，蒸馏水洗3 min。褪色后的涂片经蒸馏水洗后3%H2O2阻断内源性过氧化物酶活性，室温15～20 min。用免疫组化油笔将涂片划好区域，并分别滴加相应的一抗BRAF（VE1）和CyclinD1，室温下孵育2 h。1×PBS 室温漂洗3 次，2 min/次，擦干组织周围水滴，在组织上滴加二抗，于湿盒中室温孵育15～18 min，1×PBS 室温漂洗3 次，2 min/次，滴加DAB 液，于湿盒中室温显色5 min。甲状腺癌分子标志物诊断标准：BRAF（VE1）阳性表达主要分布为细胞质上，CyclinD1 蛋白阳性表达主要分布于细胞核上，均呈现棕黄色颗粒。评分标准根据着色强度及阳性细胞率评估，0、1、2、3 分依次表示无着色、淡黄、棕黄、棕褐色，阳性细胞中0、1、2、3 分依次表示着色细胞<5%、5%～25%、26%～50%、>50%。阳性判断标准：综合评分≥2 分即为阳性（2～3 分为弱，4～6 分为中，>6 分为强），0～1 分表示为阴性。

1.3 观察指标及评价标准 统计不同技术阴阳性检出情况，并分析不同技术的诊断价值：以术后组织病理学结果作为甲状腺结节性质判断的金标准，分析US-FNAB 检查、ICC 技术[BRAF（VE1）和CyclinD1 蛋白检测]及联合策略技术（同时满足US-FNAB、ICC 技术诊断阳性或阴性，若存在一阴一阳或诊断不明确均纳入阴性）判断甲状腺结节恶性的敏感度（诊断技术真阳性例数与病理诊断阳性例数比值）、特异度（诊断技术真阴性例数与病理诊断阴性例数比值）、阳性预测值（诊断技术真阳性例数与诊断技术阳性筛查出的总样本比值）、阴性预测值（诊断技术真阴性例数与诊断技术阴性筛查出的总样本比值）、准确率（诊断技术真阳与真阴性之和与总样本数比值）。

1.4 统计学处理 采用SPSS 23.0 软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（）表示；计数资料以率（%）表示，比较采用χ2检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病理诊断结果 收集术后组织病理学资料及随访资料，结果显示200 例甲状腺结节患者，恶性结节63 例，均为甲状腺癌；良性结节137 例，分别为甲状腺腺瘤27 例，桥本甲状腺炎23 例，结节性甲状腺肿87 例。

2.2 不同诊断策略检查结果 US-FNAB 检查结果，阳性47 例，阴性126 例，误诊11 例，漏诊16 例，见表1；ICC 技术检查结果，阳性40 例，阴性121 例，误诊16 例，漏诊23 例，见表2；联合策略检查结果，阳性54 例，阴性129 例，误诊8 例，漏诊9 例，见表3。

表1 US-FNAB检查结果（例）

表2 ICC技术检查结果（例）

表3 联合策略检查结果（例）

2.3 不同技术诊断价值分析 三种诊断策略特异度、阳性预测值对比，差异均无统计学意义（P>0.05）；而三种诊断策略敏感度、阴性预测值、准确率对比，差异均有统计学意义（P<0.05）；且联合策略敏感度（85.71%）、阴性预测值（93.48%）、准确率（91.50%）均最高。见表4。

表4 不同技术诊断价值分析（%）

3 讨论

US-FNAB 为当前评估甲状腺结节性质常用诊断技术，其操作可以提高FNAB 操作取材成功率和诊断准确率，但由于该技术操作与病理医生经验水平相关，此外临床认为该检查技术为定性检查，缺乏客观指标，仍存在部分结节难以准确定性[9-10]。因此临床提出US-FNAB 无法准确判断者可联合检测甲状腺癌分子标志物提高诊断精确度[11]。

CyclinD1 又被称为甲状旁腺腺瘤基因，细胞生长因子可以通过适量c-myc 诱导其过表达，而过量c-myc 诱导将会抑制CyclinD1 表达，当CyclinD1 表达出现异常将会导致细胞失去对生长因子依赖性，出现下拨增殖过度，继而诱发甲状腺细胞恶变。目前已有研究显示，CyclinD1 过表达与甲状腺癌发生、发展及不良预后相关，可作为甲状腺结节良、恶性及评估甲状腺侵袭、转移能力的分子指标之一[12]。BRAF 基因是Raf 基因家族的重要一员，有报道显示BRAF 基因突变与甲状腺癌的发生密切相关，突变主要发生在第15 号外显子上第1 799 位点[13]。目前识别BRAF V600E 突变的方法包括实时聚合酶链式反应分析、焦磷酸测序、桑格测序等，这些方法有高度敏感性，但其要求高质量的实验室环境和特殊的设备，操作复杂、周转时间长、成本昂贵、专用技术人员等，大多数基层医院尚不能开展。Rashid 等[14]指出，免疫组织化学中VE1 抗体是检测甲状腺癌BRAF V600E 突变特异和敏感的方法。免疫细胞化学（ICC）是利用抗原和抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子和同位素）显色来确定细胞内抗原的成分（主要是多肽和蛋白质），对其进行定位、定性、定量的研究。

本研究结果显示，联合策略的敏感度（85.71%）、阴性预测值（93.48%）、准确率（91.50%）均最高。说明US-FNAB、CyclinD1 蛋白过表达、BRAF（VE1）联合检测是鉴别甲状腺结节性质的有效指标，更有利于判断恶性结节。US-FNAB 仍存在一定应用局限性，对于部分分化不良组织、囊性或穿刺技术较差操作者，其诊断效能将会受到较大影响[15-16]。而ICC 技术具有原理清晰、操作简单等优势，通过不同检测途径提高诊断精确度[17-20]。本研究的创新之处在于联合US-FNAB 及ICC 技术，检测BRAF（VE1）和CyclinD1 蛋白表达，为病理诊断提供客观指标，对甲状腺结节进行诊断分析，探讨其在甲状腺结节早期诊断中的应用价值，有助于甲状腺癌临床预后预测，便于制订个体化的诊治方案，尽量避免误诊及过度治疗，且当前此领域的研究在省内尚属空白。但由于联合策略[USFNAB+CyclinD1+BRAF（VE1）]诊断研究报道相对较少，且本研究样本数量较少，其结果可能存在偏倚，仍有待更多试验证实。

综上所述，联合策略[US-FNAB+CyclinD1+BRAF（VE1）]应用于甲状腺结节性质诊断中价值较高，可提高单一诊断敏感度、阴性预测值、准确率，降低漏诊、误诊风险。