Notch信号通路在结直肠癌中的研究进展*

丁志浩 综述，张晓东 审校

(武汉大学生命科学学院，湖北 武汉 430072)

2020年新增结直肠癌病例190万例，死亡93.5万例，占所有癌症病例和死亡人数的1/10，是男性排名第3位、女性排名第2位的常见癌症[1]。结肠直肠癌的大多数病例均不是单一因素导致的。除性别、年龄因素外，流行病学研究还鉴别出下列危险因素，如遗传、炎症性肠病、吸烟、肥胖、酗酒、大量食用红肉和加工肉类、糖尿病等。此外，感染幽门螺杆菌等其他致病因子也可能增加结直肠癌患病风险[2]。虽然药物和手术治疗方法不断发展[3]，但结直肠癌患者病死亡率依然很高。结直肠癌的发病原因多种多样，涉及许多细胞通路，Notch信号通路正是其中之一[4]，而且最近许多研究已证明Notch信号是结直肠癌发生、发展的关键[5]。因此，本文较为细致地描述了Notch信号通路，以及针对Notch通路的特定蛋白治疗结直肠癌的方法。

1 Notch信号通路简述

Notch是摩尔根于1917年在果蝇突变体中发现的，并且证明其是X连锁的隐性致死基因。1983年，果蝇Notch基因首次被分离出来[6]；2年后其序列被公布[7]。Notch受体和配体基因存在于所有后生动物中，足以见其进化的保守，在胚胎发生期间相邻细胞通过Notch交换信息决定细胞分化命运[8]。Notch信号通路调节多种细胞生命活动，包括增殖、干细胞维持、分化和死亡[9]。

1.1Notch配体和受体的结构 人类Notch有5个配体和4个受体，配体Jagged-1、Jagged-2、Delta-like-1(Dll-1)、Delta-like-3(Dll-3)、Delta-like-4(Dll-4)是包含表皮生长因子(EGF)样重复的单通道跨膜蛋白DSL(Delta/Serrate/Jagged)家族的成员[10]。Notch通路的4个受体(Notch-1、Notch-2、Notch-3、Notch-4)均为跨膜糖蛋白，均由1个胞外结构域、1个跨膜结构域、1个膜内或细胞质结构域组成[11]。见图1A。Notch受体的胞外结构域由多个EGF重复序列和负调控区(NRR)组成，NRR由3个Lin12-Notch重复序列(Lin-12 and Notch repeats、Lin-12、Notch重复序列)结构域和异二聚结构域组成。Notch受体的细胞内结构域从近膜端到远膜端依次为重组信号结合蛋白为免疫球蛋白kappa J区相关分子结构域、锚蛋白重复序列、C端TAD拓扑相关结构域(反式激活结构域)，TAD结构域由3个核定位序列和末端富含脯氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氦酸的约10个氨基酸组成的结构序列(富含脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸和苏氨酸)序列组成。Notch配体DSL的胞外结构域包括1个Notch配体N端模块结构域、DSL结构域和近膜额外的EGF重复序列[12]。

1.2Notch蛋白的产生 Notch蛋白首先被运输至内质网，将来的细胞外亚基被蛋白蛋白质O-岩藻糖转移酶1(PoFuT1)、蛋白质O-葡糖基转移酶1或EGF结构域特异性O-连接N-乙酰氨基葡萄糖转移酶糖基化，随后还可能被N-乙酰葡糖胺糖苷酶继续糖基化。糖基化修饰调节了Notch受体对不同配体的亲和力，随后糖基化的前体通过高尔基体运输。Notch前体在S1位点被高尔基体反面管网区中的一种Furin样蛋白酶裂解，产生非共价结合的Notch细胞外异二聚体，之后异二聚体作为Ⅰ型跨膜蛋白运输至细胞膜上[12]。细胞膜上Notch受体蛋白数量时刻处于动态，受组成型内吞作用调控，泛素连接酶神经前体细胞表达发育性下调蛋白4促进该过程。从高尔基体释放的Notch可被运输至质膜上，也可被输送至溶酶体降解或在核内体中储存。NUMB可阻止Notch再运输至质膜，并通过Deltex/ITCH促进其泛素化，并转运至溶酶体降解。在果蝇中Deltex能促进胞内体中Notch的激活，但在哺乳动物中DTX1(即人源Deltex)却是一个负调控因子[13-14]。见图1 B。

1.3Notch信号通路的激活 在经典的Notch通路中配体与相邻细胞之间的Notch受体结合，Notch被激活并发生2次切割。首先解整合素金属蛋白酶10(ADAM10)/ADAM 17在Notch胞外的S2位点切割，去除Notch受体的胞外结构域，并产生细胞外截短体[15]，随后由γ-分泌酶复合体——PEN-2和前咽缺陷因子-1，在S3位点切割(切割过程既可以发生在细胞膜，也可以发生在胞内体)产生Notch胞内结构域(NICD)，然后NICD转移至细胞核[16]，结合CSL(C-端重复/DRE结合因子1/无毛抑制因子/延长酵母的寿命的基因1)复合体。见图1C。在NICD不存在的情况下CSL作为沉默因子抑制转录。NICD的结合招募了转录激活复合物，包括类似转录辅激活因子1～3、Ski作用蛋白/cAMP反应元件结合蛋白/p300组蛋白乙酰转移酶、激活CSL转录复合体等[17]激活下游发状分裂相关增强子1等基因。见图1C。非经典Notch信号通路可以由非经典Notch配体激活或不需要配体也能激活，Notch受体也可以不被切割，某些非经典途径甚至不需要核内CSL复合物，而是与其他效应器发生相互作用。图1C。在T淋巴细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)中NICD1与IκB激酶α/IκB激酶β相互作用激活核因子κB[18]，在T淋巴细胞中NICD1也可以激活蛋白激酶B信号通路[19]。非经典Notch信号通路的研究才刚刚开始，内容太过宽泛而难以描述，但这些新的激活方式却是很好的药物靶点[20]。

2 Notch信号通路与结直肠癌

2.1Notch信号通路与肿瘤 由于Notch的重要性，其在癌症发生、发展中扮演了双刃剑的角色。在T-ALL、慢性淋巴细胞白血病[21]、三阴乳腺癌[22]和非小细胞肺癌[23]中均能检测到Notch基因的功能获得性突变。在结直肠癌[24]、前列腺癌[25]、胶质母细胞瘤、其他恶性肿瘤中发现，Notch信号下调或失活。甚至在同种癌症中Notch也扮演着相反的角色，Notch在T淋巴细胞恶性肿瘤(如T-ALL)和慢性淋巴细胞白血病中具有致癌作用，但在B细胞急性淋巴细胞白血病、慢性粒单核细胞白血病、急性髓系白血病中却具有抑癌作用[26-27]。

2.2Notch信号通路与结直肠癌 Notch在上皮细胞-间质转化(EMT)中扮演着重要的角色，在此过程中上皮细胞获得间充质表型，最终导致迁移。在内皮细胞中Notch-1通过启动子中的E-box间接抑制E-钙黏蛋白基因表达，诱导EMT[28]。抑制Notch可以下调Snail的表达，从而抑制乳腺癌的耐药性[29]。Slug蛋白可以抑制Dll-4-Notch信号通路，并促进血管内皮生长因子受体2的表达，有利于肿瘤血管的生成[30]。此外，转化生长因子-β信号通路可增加Notch配体的表达，诱导EMT，而且转化生长因子-β诱导的EMT可通过Jagged-1敲除或Notch失活来阻断[4]。Notch在维持正常肠上皮细胞中发挥着重要作用[31]，同样Notch在结直肠癌中也发挥着关键作用，敲除Jagged-1的结肠癌细胞的生长速度比对照组慢得多,Jagged-1缺失是促进大肠癌发生的重要原因，该过程通过抑制肿瘤细胞分化并促进血管生成而诱发肿瘤[32]。HES1是Notch-1的下游因子，可抑制Kruppel样因子(KLF4)，而高表达KLF4对结直肠癌具有抑制作用[33]。基质金属蛋白酶9可强烈上调Notch1，并诱导EMT[34]。与普通结直肠癌细胞系比较，在肿瘤干细胞中Notch信号通路增强了10～30倍，Notch通过抑制细胞周期激酶抑制剂——p27和转录因子——无调节性bHLH转录因子1阻止肿瘤干细胞凋亡，且Notch对肿瘤干细胞自我更新的维持和分泌细胞分化基因(如黏蛋白2)的抑制也至关重要[35]，这有利于其保持干细胞特性。有研究发现，Notch1基因拷贝数的增加与晚期结直肠癌患者的较差生存率显著相关，结直肠癌患者来源的肿瘤异种移植模型中Notch1表达上调的肿瘤表现出Notch1、JAG1和NICD1的显著升高，而用Notch1抗体靶向这一患者群体可能会有所改善[36]。大量mRNA测序证明，Notch靶基因——HES1在人结直肠癌中均有表达，且JAG配体、NOTCH和HES1的表达水平均有所升高，这些基因表达的变化是结直肠癌的一致特征。有趣的是，Notch1和Notch2对结直肠癌患者具有相反的预后影响，且Notch1阳性协同Notch2阴性会导致患者更差的整体生存率[37]。

3 靶向Notch的治疗方法

结直肠癌的传统治疗方法包括手术方法和化学药物资料，如西妥昔单抗、伊立替康、氟尿嘧啶、亚叶酸钙已被用于治疗结直肠癌[38]。因Notch无处不在，所以，产生了泛Notch抑制的简单治疗策略，但这种治疗方法会无差别攻击细胞，所以，针对泛Notch抑制策略的缺点产生了很多靶向性治疗方法。

3.1γ-分泌酶抑制剂(GSIs) GSIs是第一个，也是目前研究最广泛的小分子Notch抑制剂。这些GSIs最初是作为阿尔茨海默病的研究药物开发的。GSI干扰Notch激活的S3切割和蛋白水解步骤，阻止NICD的释放。从理论上讲，这些GSIs均是泛Notch抑制剂，由于γ-分泌酶参与多种底物的裂解反应，所以，GSIs不是Notch特异性试剂[39]，GSIs的缺点之一是肠道毒性。Notch1和Notch2调节肠上皮细胞和杯状细胞系之间的肠隐窝干细胞分化，在缺乏Notch1和Notch2的情况下肠干细胞多数向杯状细胞系分化。在体外实验中DAPM(一种GSI抑制剂)可上调KLF4和p21的表达。与对照组比较，DAPM处理的小鼠结肠肿瘤中KLF4、p21水平升高，而Ki-67染色降低[40]，表明DAPM在治疗结直肠癌通过KLF4通路发挥功能。

3.2γ-分泌酶调节剂(GSM) GSM是一种小分子物质，可以在不作为竞争抑制剂的情况下改变γ-分泌酶的催化活性。在发现GSIs的不良反应后研发工作者旨在开发GSMs，使其在调节Notch的同时保留Notch的切割活性，如早老素1选择性GSM(MRK560)在T-ALL动物模型中抑制突变Notch1的切割，却不会引起肠道毒性[41]。

3.3ADAM抑制剂 ADAM10和ADAM17在配体介导的Notch激活中完成细胞外S2位点的切割。目前，一种新型ADAM17抑制剂——ZLDI-8通过抑制Notch通路达到抑制结直肠癌细胞增殖的效果。该研究也经过体内实验证明，ZLDI-8通过抑制Notch而抑制EMT，也能协同5-氟尿嘧啶或伊立替康提高这2种药物的抗肿瘤和抗转移活性[42]。

3.4Notch糖基化调节剂 POFUT1采用O-岩藻糖修饰Notch受体细胞外亚基的EGF重复序列。这些糖基化对正确的Notch信号传导至关重要。6-炔基岩藻糖和6-烯基岩藻糖[43]这2个糖基类似物是POFUT1的底物，可以被催化并连接上Notch的EGF重复序列，其均是Notch配体Dll-1和Dll-4与Notch1结合并激活Notch1的有效抑制剂，但并不影响Jagged-1的功能，这种定向抑制剂具有作为靶向药物的潜力。

3.5治疗性微小RNA(miRNA) miRNA作为癌症的潜在生物标记物和治疗学正在受到关注。miR-598可抑制结直肠癌细胞中的EMT，并被证明可降低Jagged-1 mRNA的表达[44]。miR-195-5p在结直肠癌组织中显著下调，而TCGA-COAD数据库中低水平的miR-195-5p患者的总生存期显著缩短，miR-195-5p通过结合Notch2和CSL mRNA的3′非翻译区抑制结直肠癌细胞的干细胞样能力[45]。

3.6单克隆抗体、抗体-药物结合物和靶向免疫疗法 为规避泛GSIs的局限性，一些实验室和生物公司已开发出针对特定Notch受体或配体的单克隆抗体，现已开发出2类阻断抗Notch药物，一类针对Notch受体的NRR；另一类针对Notch受体的细胞外配体结合域(LBD)。从抗体噬菌体展示库中生成单链抗体形式的抗Notch抗体，并用Luciferase发现了6种针对Notch1的NRR的抗体和4种识别Notch2的NRR的抗体，能阻止Notch激活。与广泛使用的小分子GSIs比较，抗体能以一种高度特异性的方式封闭单个Notch蛋白[46]。有学者开发了一种针对Notch1 LBD的单克隆抗体(23814)，该单克隆抗体可在人和小鼠细胞中特异性阻断配体诱导的Notch1激活，阻断血管生成并抑制肿瘤生长，而无胃肠毒性[47]。JIMENO等[48]开发的Dll-4和VEGF双特异性抗体(OMP-305B83，navicixizumab)的在转移性结直肠癌与叶酸、5-氟尿嘧啶和奥沙利铂或伊立替康联合化疗的一期研究也已经完成。

3.7天然化合物 来自植物的天然化合物可能会成为更好的选择，如槲皮素联合低剂量电离辐射可显著降低HT-29、DLD-1细胞中γ-分泌酶复合物5种蛋白的表达，有效治疗结直肠癌[49]。青蒿素(一种抗疟疾剂)可抑制BMI1(一种多克隆转录抑制因子，在几种癌症的肿瘤干细胞中致癌并上调)的表达，并降低Notch1和靶基因——HES1、MYC的表达，但遗憾的是该抑癌效果发生于T-ALL细胞中，而非结直肠癌[50]。

总之，现阶段多种药物治疗策略均在不断深入，这些Notch相关药物的单一使用效果可能一般，但联合使用会大大提升其疗效。

4 小结与展望

虽然结直肠癌的诊治技术有了巨大进步，但结直肠癌的发病率和致死率仍居高不下，并且还具有向年轻化发展的趋势。不幸的是，社会的进步并没有减少结直肠癌的出现，且结直肠癌发生率与社会发展水平呈正相关。因此，研究结直肠癌发生、发展的机制也很有必要。

Notch作为最保守的细胞信号通路之一，参与了众多最基本生物学过程。正常的Notch调节着细胞的增殖、分化和死亡，异常的Notch失去调节能力经常会造成细胞的癌变。而且Notch与其他许多重要信号通路，如RAS、蛋白激酶B、核因子κB相互作用，探究其信号交叉方式、寻找关键的中间蛋白能更深入地了解结直肠癌的发病机制，为开发更有效的药物和治疗方案提供帮助。

了解Notch信号通路有助于建立Notch通路相关的结直肠癌分子标志物，如Notch1、JAG1、NICD1等蛋白在结直肠癌中异常表达可作为早期筛查和判断预后的检测标志物。目前，针对Notch通路的肿瘤抑制剂和治疗药物也被迅速开发。与传统化疗比较，靶向药物针对性更强，具有更高的疗效和更小的毒性。现有的靶向药物主要针对Notch信号通路的γ分泌酶、ADAM蛋白、NICD复合体、NRR区域、LBD区域、配体的糖基化位点等。目前，正在致力于寻找特异性更高、毒性更低的抑制剂。同时，为防止抑制剂影响Notch通路正常的功能，Notch调节剂也被广泛研究，其可以在抑制癌细胞的同时不影响体细胞的正常生长。另外，很多天然化合物的提取物也可以抑制Notch信号通路，而且已被证实在乳腺癌、肺癌、白血病中具有良好的效果，其毒性也远小于人工合成的小分子抑制剂，将来这些天然产物有希望用于治疗结直肠癌。虽然很多靶向药物如今仍在试验阶段，但期待随着Notch信号通路研究的深入，结直肠癌的靶向治疗方案会有更多的选择，结直肠癌的治疗水平整体得到提高。