星形细胞瘤中YAP1和β-catenin的表达及临床联系*

赵玉红，邵 伟，吴淑华，李 勐

(滨州医学院附属医院：1.病理科；2.神经外科，山东 滨州 256600)

星形细胞瘤是较常见的神经上皮源性颅脑肿瘤，由胶质细胞异常增生所致。根据异型特点及分化将其分成4个级别，Ⅰ级恶性水平最低，患者预后最佳；Ⅳ级则相反。恶性胶质瘤细胞通常呈浸润性生长，手术无法完全切除，复发率较高[1]。虽然手术，放、化疗等是治疗胶质瘤的常见方式，但疗效不佳，1年生存率仅为57%[2]。因此，探究脑星形细胞瘤发生、发展的分子机制具有重要的临床指导意义。Hippo-Yes相关蛋白(YAP)通路首次发现于果蝇中，其作用在于为细胞传导信号提供渠道,可以使细胞在繁殖与死亡时基本实现均衡。YAP1为该通路中介入转录的一种重要物质，其单独情况下不发挥作用，在人体中主要是以磷酸化的方式介入信号传导工作。有关动物实验表明，YAP1能使胶质瘤细胞内Wnt/β-联蛋白(β-catenin)通路介入肿瘤细胞的繁殖[3-4]。为检测人星形细胞瘤中是否也存在这种调节模式，本研究使用免疫组织化学(免疫组化)法检查了人各级星形细胞瘤中YAP1和β-catenin的表达并分析了Hippo与Wnt信号路径在星形细胞瘤发生及恶性进展中的作用，以及彼此间的影响与临床价值。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1一般资料 选取2013年1月至2020年12月本院收治的确诊且有完整病理检查资料的星形细胞瘤患者52例，其中男32例，女20例；年龄4～77岁，中位年龄36岁；Grade分级Ⅰ～Ⅱ级15例，Ⅲ级19例，Ⅳ级18例。选取同期收治的脑减压术后正常脑组织10例作为对照组。切取组织前均未经放、化疗，由2名副高级专业技术职务的病理医师依据苏木精-伊红染色切片及蜡块筛选确定入选病例。

1.1.2试剂 浓缩型YAP1一抗购自艾博抗(上海)贸易有限公司，兔抗人β-catenin即用型抗体购自中杉金桥生物技术有限公司，阳离子防脱片、通用型二抗PV-6000、磷酸盐缓冲液(PBS)、乙二胺四乙酸(pH 8.0)修复液、二氨基联苯胺显色试剂盒均购自中杉金桥生物技术有限公司。复染用苏木素、分化液所需盐酸、脱水涉及的不同浓度乙醇试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2方法

1.2.1检测方法 运用免疫组化Elivision两步法，筛选好的蜡块以4 μm厚度切片并捞于免疫组化专用载玻片上，70 ℃烤片30 min，常规脱蜡至水。用PBS冲洗3次，每次3 min。取出切片放置于高压锅乙二胺四乙酸(pH 8.0)修复液(按说明书标准配置)内隔水热修复13 min，冷却至室温后水洗切片，用PBS冲洗3次，每次3 min。3%过氧化氢液室温孵育切片15 min后水洗，用PBS冲洗3次，每次3 min。滴加一抗(YAP1稀释度为1∶200；β-catenin为即用型)后置于4 ℃冰箱过夜。次日由冰箱中取出复温后水洗10 min后用PBS冲洗3次，每次3 min。滴加通用型二抗PV-6000，置37 ℃温箱孵育30 min，取出后水洗5 min后用PBS冲洗3次，每次3 min。用新鲜配置的二氨基联苯胺显色液显色，光学显微镜下控制，达到显色标准及时入水终止显色，苏木精复染，1%盐酸乙醇分化，常规脱水封片。用前期筛选好的阳性切片进行阳性对比，用PBS代替一抗进行阴性对比。

1.2.2结果判读 邀请2名单独的研究人员评价有关的免疫染色切片的得分，其对患者的临床资料毫不了解。按染色强度除以阳性细胞获得的结果核算分数。使用阳性细胞百分比作为评分标准：0为低于5%的细胞(弱阳性)，1+为5%～<25%的细胞(弱阳性)，2+为25%～50%的细胞(阳性)，3+为超过50%的细胞(强阳性)。利用着色强度评分标准：0为无染色，1+为淡黄色，2+为深黄色。参考染色强度和阳性细胞分数相加的数据得到相关化学染色得分标准：0～1为阴性，2+为弱阳性，3～4++为中度阳性，5+++为强阳性。

1.2.3用癌症基因组图谱(TCGA)数据库进行基因生存分析 OncoLnc属于一种交互型尝试生存关系的工具，使用在下载与mRNA、微小RNA或长链非编码RNA(lncRNA)表达有关的临床信息上。OncoLnc涵盖了源于TCGA中记载的33种癌症分析数据，累计纳入了超过8 650例患者的生存信息及源于TCGA数据库的mRNA与微小RNA的RNA-SEQ表达数据，其他源于MiTranscriptome beta数据库的lncRNA表达也记载于其中。用户可利用特定基因的表达对肿瘤患者实施分组处理，接着开展Kaplan-Meier研究或下载信息以便深入地开展研究。OncoLnc还保管了过去核算的生存资料，方便使用者在短时间内查询各种癌症之间的生存关系。此数据库可以使用户在短时间内查询某种固定基因在不同种类癌症中的表达，不仅如此，还能明确和其有关的新型lncRNA。

1.3统计学处理 应用SPSS23.0统计软件进行数据分析，计数资料以率或构成比表示，采用χ2检验、Fisher确切概率法等；采取Pearson检验进行相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1不同级别星形细胞瘤及正常脑组织中YAP1和β-catenin表达比较 正常脑组织中YAP1表达极少，主要着色部位为个别神经胶质细胞；β-catenin无明显表达。星形细胞瘤中YAP1主要表达于细胞质及细胞核，β-catenin在细胞膜、细胞质、细胞核中均有表达，二者表达强度均随肿瘤级别增高而增强。见图1。

2.2YAP1和β-catenin表达与星形细胞瘤患者临床病理特征的关系 星形细胞瘤中YAP1的表达主要受肿瘤大小、分级影响，β-catenin的表达主要受肿瘤分级影响，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1、2。

表1 YAP1表达与星形细胞瘤患者临床病理特征的关系[n(%)]

2.3YAP1和β-catenin在不同级别星形细胞瘤中表达的相关性 星形细胞瘤中YAP1 和β-catenin的表达呈正相关(r=0.553，P<0.05)。见图2。

表2 β-catenin表达与星形细胞瘤患者临床病理特征的关系[n(%)]

2.4YAP1表达与星形细胞瘤患者预后的关系 在低级别胶质瘤、高级别胶质瘤中YAP1高表达组患者生存期均较低表达组明显缩短。见图3。

3 讨 论

Hippo信号通路由一系列保守激酶组成，是调控细胞生长、增殖、凋亡的关键通路，YAP1位于下游，是通路核心效应分子。YAP广泛存在于性腺细胞、上皮细胞、肌肉细胞等细胞质和细胞核中，本身并不具有转录活性，其是用磷酸化的方式介入细胞的信号传导和下游靶分子的转录过程。Hippo-YAP1信号通路可与Wnt/β-catenin[5]、上皮生长因子受体[6]、磷酸肌醇-3激酶/哺乳动物雷帕霉素蛋白[7]、上游激活蛋白信号通路[8]等其他信号通路相互作用。Wnt/β-catenin通路是一个复杂的蛋白质作用网络，与肿瘤的发生、发展密切相关。细胞膜上的β-catenin可以与钙粘蛋白E结合起到连接细胞的作用，也可以在Wnt通路中以下游因子的身份入核并在细胞核内激活转录因子，影响细胞的转录[9]。通常情况下β-catenin位于降解形态时会让细胞中保留较少的β-catenin。在获得有关信号干预后β-catenin在细胞中无法被分解，如此将集中进入细胞核中，干扰下游基因的转录。活化的YAP1一般集中在细胞核内发挥作用，但最新研究发现，细胞质内YAP1也可通过促进β-catenin降解、抑制Wnt信号通路的方式起到抑制肿瘤的作用[10]。

YAP1在多种肿瘤中表达增多影响肿瘤进展和患者预后。MURAMATSU等[10]发现，在人类食管鳞癌染色体中YAP1基因能够繁殖，形成高表达，增进食管鳞癌的演化。LIU等[11]研究表明，YAP1在子宫颈鳞癌的细胞质中为高表达，而在细胞核中正好相反；在子宫颈腺癌中YAP1呈现出细胞核高表达。因此，判定YAP1细胞定位与细胞功能密切相关。另有相关研究表明，胃癌中YAP1细胞核表达是独立的预后影响因素[12]。有研究发现，非小细胞肺癌中 YAP1作为促癌基因加速了肿瘤的进展，但在乳腺癌中YAP1表达缺失，作为抑癌基因发挥作用[13-14]。BARRY等[15]和WANG等[16]研究表明，结肠癌患者中YAP1和β-catenin出现双核阳性者生存期更短，提示YAP1在人结直肠癌中具有抑癌基因和促癌基因的双重作用。ORR等[17]发现，高级别胶质瘤中YAP1的表达量远高于正常脑组织，胶质母细胞瘤(Ⅳ级)中YAP1细胞核阳性率大于10%，且与生存时间呈负相关[18]。以往研究发现，YAP缺乏相关DNA结合结构域，不能单独发挥作用，但YAP能通过与目标转录因子，如TEA结构域转录因子(Tead)结合而发挥作用[19]。Wnt通路失活的状态下YAP与β-catenin的N-末端结构域结合并一起移动至细胞核中，YAP和β-catenin各自与Tead和 T细胞因子相互作用形成YAP-Tead-β-catenin-T细胞因子转录复合物，调节细胞转录；当Wnt被激活时YAP和β-catenin从复合物中脱离出来，YAP从细胞质转移至细胞核，激活Hippo通路，上游因子磷酸化YAP，参与Wnt信号通路的调节并阻碍β-catenin的核定位，进而影响其转录活性。β-catenin在多种肿瘤细胞中发挥作用依赖于Wnt蛋白的表达，其在肿瘤细胞膜、细胞质、细胞核均可表达。而YAP1在肿瘤细胞中磷酸化前后也呈现出不同的细胞定位。因此，YAP1在多种肿瘤形成中具有组织细胞特异性且作用并不明确，在不同级别星形细胞瘤中发挥抑癌还是促癌作用也不清楚。不同激活方式、涉及的下游通路决定了二者表达及相互作用时的多种定位组合；肿瘤类型也影响了YAP1和β-catenin的相互关系。

本研究结果显示，YAP1主要定位于星形细胞瘤的细胞核及细胞质。在星形细胞瘤中的表达高于正常脑组织。高级别星形细胞瘤中表达明显高于低级别星形细胞瘤中的表达。在高级别星形细胞瘤中YAP1细胞核阳性率明显提高，相关生存分析也显示了与文献报道的高度一致性。此外，相关分析显示，星形细胞瘤中YAP1和β-catenin的表达呈正相关，这意味着YAP1和β-catenin在星形细胞瘤的繁殖活动中的确具有协同效果。进一步与临床参数分析发现，YAP1和β-catenin在星形细胞瘤的表达主要与肿瘤大小、级别相关，同时，YAP1和β-catenin的协同作用使患者寿命大为缩短。与前期多种相关研究结果较为吻合，为深入分析星形细胞瘤的发病原因奠定了理论基础。但本研究也观察到，YAP1主要在星形细胞瘤的细胞核和细胞质表达；β-catenin则主要表达于细胞膜和细胞质，细胞核中表达较少，越高级别星形细胞瘤中β-catenin更倾向于集中在细胞膜上。二者在星形细胞瘤中呈现复杂的细胞定位。尽管如此，二者细胞定位的组合未影响其在肿瘤中的表达差异及相关性。涉及大肠癌的一篇文献提到，Hippo下调和β-catenin上调是由于磷酸化后的YAP和存在于细胞质中的β-catenin结合后影响β-catenin的入核[20]。这就很好地解释本研究在星形细胞瘤中观察到的YAP1和β-catenin的细胞定位情况。

综上所述，YAP1和β-catenin在人星形细胞瘤中有表达差异且呈正相关，不受二者细胞定位的影响，YAP1和β-catenin的协同表达影响患者预后，二者可作为调节星形细胞瘤发生、发展的生物学标记。此外，鉴于本研究样本数及研究方法的局限性，只初步探讨了星形细胞瘤中YAP1和β-catenin在转录水平上的相互作用。而作为较易发生恶性转化的肿瘤，星形细胞瘤的进展很大程度上取决于血管增殖，新生血管的大量增加加速了肿瘤浸润、生长并破坏周围脑组织。Hippo信号通路能调节VEGF，β-catenin也可介入基质金属蛋白酶的转录，这都是涉及血管形成的相关调控机制[21]。Hippo/YAP1和Wnt/β-catenin通路在星形细胞瘤血管增殖中发挥作用的具体过程及与其他信号通路的交互作用将是今后研究的重点。下一步计划扩充病例数，在分子水平上进一步增加血管增殖方面的检测，进一步探寻干扰星形细胞瘤恶化进展的结合点。