高浓度木质纤维素原料酶解过程分析

陈小燕，张荣清,2，简雅婷,3，余 强，王忠铭，袁振宏

(1.中国科学院 广州能源研究所；中国科学院可再生能源重点实验室；广东省新能源和可再生能源研究开发与应用重点实验室，广东 广州 510640；2.陕西科技大学，陕西 西安 710021;3.中国科学院大学，北京 100039；4.华南农业大学 生物质工程研究院；农业部能源植物资源与利用重点实验室；广东省农林生物质工程技术研究中心，广东 广州 510642)

木质纤维素酶解反应过程中，学者们普遍采用高浓度底物酶解，即提高生物质原料底物浓度酶解的方法来得到高浓度D-葡萄糖，以便于后续二次转化与利用[1]。高浓度底物酶解是指整个反应体系中木质纤维素浓度很高，含固体一般在150 g/L以上，酶解反应初期没有明显游离液体存在的状态[2]。高浓度生物质酶解反应过程中，纤维素底物吸收反应体系中液体发生溶胀，反应体系黏度增大，传质过程变慢，酶与底物相互作用减少，酶解效率降低[3]。酶解反应需要水分子的参与，过高的固体含量会吸收游离状态的水分子，水分子多以结合形式存在，游离水的减少会增加反应过程原料混匀所需的能量，限制了纤维素酶与底物的吸附作用，加大了传质过程与有效混匀的难度[4]。酶与底物的不均匀混合，造成酶解产物在局部积累，易对纤维素酶形成产物抑制，最终导致酶解效率降低[5]。纤维素酶与底物作用效率下降，伴随着纤维素转化效率与可发酵单糖得率呈现下降趋势，在一定程度上抵消了高浓度酶解体系的优势[2]。通过分批加料的方式可有效改善高浓度底物的效率降低问题，逐次添加较低量底物使反应体系的固体溶胀度一直保持在较低水平，从而保证纤维素酶与底物的充分接触以达到较好的酶解效果[6]。目前，已有研究表明分批补料是缓解高浓度底物酶解效率低下的有效手段之一，多次补料后生物质固体加载量达到30%以上，甚至可达40%，葡萄糖得率为60%及以上[7]。同时，研究人员亦通过改进物料混匀方式来改善酶解过程物质传递障碍[8]，并利用表面活性剂等加强酶促反应效率[9]，均取得了一定效果。此外，分布于纤维素周围的半纤维素形成了空间位阻，在一定程度上阻断了纤维素酶与底物的结合与反应，半纤维素酶的协同作用可有效加快纤维素的酶解效率，有利于产糖得率和纤维素转化效率的提高[10-11]。本研究针对高浓度底物酶解过程，分析不同酶解工艺结合半纤维素酶作用，比较几种分批补料方式对酶解效率、糖含量、可发酵单糖得率等几个方面的影响与作用，评价不同酶解工艺的作用效果，以期找到最佳的高浓度底物酶解方式。

1 实 验

1.1 原料、试剂与仪器

甘蔗渣：由广西丰浩酒精有限公司提供，晒干粉碎后过筛选取粒径为0.30～0.45 mm的原料，烘干保存备用。纤维素酶(Cellic CTec2)，按文献[12]方法测得纤维素酶酶活力(滤纸酶活力)为180 FPU/mL、半纤维素酶活力为886 IU/mL；半纤维素酶(Cellic HTec2),酶活力为6 000 IU/mL,均由诺维信公司提供。其他试剂均为国产市售分析纯。

HZ-9610KB立式恒温振荡器；Centrifuge 5417R/5804R型高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；HH-6数显恒温水浴锅；DF-101S集热式加热磁力搅拌器；Waters 2498型高效液相色谱(HPLC)仪，配置RID-2414示差检测器，美国Waters公司。

1.2 甘蔗渣酶解

1.2.1碱预处理 参考文献[13]将甘蔗渣与质量分数2%的NaOH溶液以固液比1∶10(g∶mL，下同)加入不锈钢反应器，在80 ℃下处理2 h，固液分离，得到的固体用清水洗涤数次至pH值为7左右，60 ℃烘干至质量恒定，并进行组分分析[14]。碱预处理后甘庶渣纤维素、半纤维素和木质素质量分数分别为56.3%、24.9%、9.8%。

1.2.2酶解一般过程 称取1.2.1节预处理后的甘蔗渣1.0 g，置于50 mL三角瓶，加入20 FPU/g(以底物质量计，下同)纤维素酶和pH值4.8的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，使总体积为10.0 mL。将三角瓶放置于恒温摇床，设置酶解条件为50 ℃、180 r/min，反应一定时间，在反应过程中考察机械搅拌方式、分批补料、添加半纤维素酶及低共熔溶剂类型对酶解的影响。反应过程中间隔一定时间取样，样品在12 000 r/min离心10 min后，取上清液用去离子水稀释适当倍数后用HPLC检测糖含量。

1.2.3机械搅拌方式对酶解的影响 高浓度底物酶解过程，酶解反应初始底物质量浓度为200 g/L。其中一部分样品置于恒温摇床，设置50 ℃、180 r/min进行酶解；另一部分样品置于50 ℃恒温水浴锅，利用磁力搅拌器中进行物料混匀，酶解96 h后终止反应。

1.2.4分批补料对酶解的影响 初始酶解反应底物质量浓度150 g/L，用pH值4.8 Na2HPO4-柠檬酸缓冲液充分浸润底物，加入20 FPU/g的纤维素酶，50 ℃酶解12 h后体系中液体含量提高，补料添加100 g/L 碱处理甘蔗渣，继续酶解至 24 h，发现酶解程度较低，仍有大量固体底物未能酶解，此时若进行补料会导致酶解混合物含水量过低混合不均匀。酶解36 h后，固体底物液化程度较高，进行二次补料100 g/L，使反应底物添加总质量浓度为350 g/L，酶解反应持续至96 h。

1.2.5添加半纤维素酶对酶解的影响 选取了半纤维素酶HTec2与纤维素酶对甘蔗渣进行复合酶解。初始底物质量浓度为200 g/L开始酶解，添加20 FPU/g纤维素酶与1 000 IU/g半纤维素酶，其中纤维素酶CTec2中含有半纤维素酶约100 IU/g。经多酶复配酶解12 h后添加80 g/L的固体和15 FPU/g 纤维素酶与500 IU/g半纤维素酶，继续反应至36 h，添加70 g/L的固体和15 FPU/g纤维素酶与500 IU/g半纤维素酶，酶解反应持续至96 h。

1.2.6低共熔溶剂对酶解的影响 分别以甘油(G)、尿素(U)、乙二醇(EG)为氢键供体，按照物质的量之比2∶1加入氯化胆碱(ChCl)，混匀后置于高温反应釜，参考文献[15]制得3种低共熔溶剂(DES)：ChCl/G、ChCl/U和ChCl/EG。

以2%碱处理后甘蔗渣为底物进行酶解，置于含有20 FPU/g纤维素酶的pH值4.8缓冲液中，反应中分别添加ChCl/G、ChCl/U和ChCl/EG，添加量分别为1%和5%(体积分数，下同)，充分混匀后按1.2.2节方法酶解48 h后，取样检测糖质量浓度并计算酶解率。

1.3 分析与表征

1.3.1HPLC分析 酶解产物中糖质量浓度检测使用HPLC分析，色谱柱为Shodex sugar SH-1011，进样量10 μL，流动相为0.005 mol/L H2SO4，流速为0.5 mL/min，色谱柱与检测器温度均为 50 ℃。

1.3.2酶解率的计算 酶解率通过式(1)和(2)计算：

Yc=(mc+mg)×0.9/mc0×100%

(1)

Yx=mx×0.88/mx0×100%

(2)

式中：Yc—纤维素酶解率，%；mc—纤维二糖质量，g；mg—葡萄糖质量，g；0.9—纤维素和葡萄糖之间的转换系数；mc0—纤维素初始质量，g；Yx—半纤维素酶解率，%；mx—木糖质量，g；0.88—木聚糖和木糖之间的转换系数；mx0—木聚糖初始质量，g。

2 结果与讨论

2.1 低共熔溶剂对酶解的影响

DES是新兴的绿色溶剂，其在木质素与半纤维素溶解方面具有显著优势，被多个研究应用于生物质预处理过程。为考察DES对甘蔗渣酶解过程的影响，选择3种DES(ChCl/G、ChCl/U、ChCl/EG)参与酶解过程，DES添加量为1%和5%。酶解后各糖含量和酶解率结果见表1。

表1 添加DES对甘蔗渣酶解的影响

由表1可知，DES添加量为1%时对酶解过程没有影响，酶解液中各糖质量浓度、纤维素酶解率和半纤维素酶解率与未添加DES时相近。添加量为5%时不同DES对酶解的影响不同，5%ChCl/EG对酶解影响很小，含有5%ChCl/G、ChCl/U酶解液中糖质量浓度和酶解率有轻微降低。DES在生物质预处理中的研究报道很多，通过多次回收与清洗过程可将大部分DES去除，但仍有极少量残留吸收在纤维素表面，研究发现残留的DES对纤维素酶产生一定抑制作用，导致DES处理生物质酶解率低于碱法处理生物质[16]。Gunny等[17]亦报道在10%DES(甘油与乙二醇型DES)中，纤维素酶可以保持90%以上的活性。同时，亦有研究表明草酸型DES作为催化剂可提高生物质基呋喃转化为马来酸和富马酸的效率[18]。DES在生物质利用领域具有重要意义，尽管本研究中DES对酶解没有促进作用，然而ChCl/EG对酶解几乎没有抑制，可见，在今后研究中可深入研究不同种类DES对酶解的影响，将对加强DES促进酶解过程具有积极作用。

2.2 混匀方式对酶解的影响

初始固体底物浓度在很大程度上影响生物质的水解程度，进而决定酶解效果。尤其是高底物浓度酶解过程，反应缓冲液使底物浸润、膨胀，形成的固液混合物黏度增加，传质速率受到限制，降低酶解速率[2]。故选择摇床混匀与磁力搅拌2种物料混匀方式，使原料与纤维素酶充分混匀，用于改善甘蔗渣酶解过程传质障碍问题。由图1可知，采用摇床混匀的酶解过程，酶解速率在12 h达到最大，12～24 h酶解速率略有下降，24 h后酶解速率变化逐渐趋于平缓。采用磁力搅拌混匀的酶解过程在12 h的酶解速率最大，随后就进入酶解缓慢期。在高浓度固体底物反应中，磁力(机械)搅拌的混匀作用更显著，酶解过程的传质更迅速，因此采用磁力搅拌方式酶解速率较摇床更高。黄娟[19]在研究高固含量玉米秸秆酶解过程中，发现酶解反应器转速的高低在酶解初期对葡萄糖质量浓度的影响较大，而转速的改变对酶解后期影响较小，对D-葡萄糖最终浓度的影响亦不显著。

图1 摇床(a)和磁力搅拌(b)对甘蔗渣酶解的影响

在糖质量浓度方面，前12 h内，采用磁力搅拌混匀方式的酶解过程得到的葡萄糖较摇床混匀方式得到的葡萄糖高20%左右，这与酶解速率结果一致。酶解96 h时，磁力搅拌混匀酶解过程得到的葡萄糖质量浓度为91.5 g/L，纤维二糖质量浓度为13.3 g/L；酶解72 h时，摇床混匀酶解的葡萄糖质量浓度最高为81.6 g/L，略低于磁力搅拌，但纤维二糖质量浓度为21.9 g/L，高于磁力搅拌混匀的反应。2种物料混匀方式中，磁力搅拌与摇床混匀分别在酶解反应容器内部、外部赋加作用力使甘蔗渣固体与酶缓冲液充分混匀，相对而言，磁力搅拌可有效减少固体结块成团，物料混合更均匀；而摇床混匀酶解过程，尤其是酶解初期，甘蔗渣未完全均匀分布，局部固体底物浓度更高，产物葡萄糖浓度高对β-葡萄糖苷酶产生抑制作用，导致纤维二糖累积。研究结果表明：2种混匀方式所得的纤维素酶解率相近，为82%～83%，说明混匀方式对纤维素酶解率影响不大。研究人员对混合方式与搅拌强度的研究表明，在摇瓶内含固体25%情况下，摇动的强度对初始水解效率影响较大，但是酶解72 h的最终水解率变化并不显著[20]。亦有研究发现，转速低于一定强度情况下，混匀转速提高可以使酶解水解率提高2倍，然而较高的搅拌转速，如超过340～510 r/min后，对酶解率的影响较小[21]。

2.3 分批补料对酶解的影响

为进一步提高固体底物浓度，进行分批补料酶解，糖质量浓度随时间的变化见图2。由图2可知，经3次分批补料，固体底物甘蔗渣质量浓度提高至350 g/L，经过96 h酶解后获得的纤维二糖、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的糖质量浓度分别为16.2、96.5、46.0和4.0 g/L，总糖质量浓度为162.7 g/L。前48 h内，纤维素持续酶解生成小分子片段，纤维二糖和D-葡萄糖的质量浓度增加速率最快，在48 h时分别达到28.6和87.9 g/L，酶解72 h，水解速率进入平缓期，β-葡萄糖苷酶仍然发挥作用将纤维二糖水解为葡萄糖，然而此时内切葡聚糖酶没有发挥活性，纤维二糖含量不再增加。半纤维素的水解趋势与纤维素相近，木糖质量浓度在48 h达到最高值，随后保持平衡。阿拉伯糖质量浓度在酶解前12 h内达到最高，随后基本保持不变。由图2(b)可知，通过3次分批次补料，酶解96 h时纤维素和半纤维素的酶解率均为51%左右。

图2 甘蔗渣分批补料酶解过程糖质量浓度(a)和酶解率(b)的变化

已有研究报道的高浓度底物分批补料酶解，所采用的底物质量浓度多数低于300 g/L，有少量文献的底物质量浓度达到350 g/L左右，表2列出部分木质纤维素原料高浓度底物酶解的有关数据。

表2 不同木质纤维素原料高浓度底物分批补料酶解结果对比

由表2看出，固体底物质量浓度在100～200 g/L的酶解反应中，纤维素酶解率可以达到80%以上，随着底物质量浓度提高至300 g/L以上，经过96 h或更长时间酶解，纤维素酶解率均低于60%。纤维素酶的酶量增加与酶解时间的延长有利于提高糖质量浓度和酶解率，但是改善效果并不显著。批次补料过程对酶解的影响也较大，如Yang等[22]以300 g/L玉米秸秆为底物，分4次进行分批料，经过144 h酶解后还原糖总糖质量浓度达到220.0 g/L。而Zhang等[23]对300 g/L甘蔗渣分批补料酶解，分别在0、8、24、48 h补料，酶解144 h后葡萄糖质量浓度达到81.9 g/L。本研究中通过2次补料，初始底物质量浓度为150 g/L，分别在12、36 h添加100 g/L底物，酶解96 h后糖质量浓度与酶解率略低于文献数据，可能是由于在底物添加过程中每批次的添加量较高，底物浓度过高导致酶解效率较低。

2.4 半纤维素酶的添加对纤维素酶解的影响

碱处理后的木质纤维素仍含有一部分半纤维素与木质素，其中半纤维素质量分数约25%，半纤维素的存在会直接影响到纤维素的酶解率，只有纤维素酶的作用，难以实现纤维素的完全酶解。木质纤维素降解微生物往往能分泌多种酶，包括纤维素酶、半纤维素酶，在它们的协同作用下形成一个复杂的酶系从而实现木质纤维素的降解[27]。尽管商业化的纤维素酶中含有一定的半纤维素酶，然而其水解能力仍然有限，额外添加半纤维素酶在木质纤维素的高效降解过程中是必需的。

酶解结果(图3)显示，经过96 h酶解，总糖质量浓度为218.9 g/L，其中纤维二糖、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的质量浓度分别为17.8、140.0、55.8、5.4 g/L，葡萄糖和木糖质量浓度较不添加半纤维酶时分别提高45%和21%。纤维素和半纤维素酶解率分别为72%和63%，较未添加半纤维素酶时提高了40%和22%，可见半纤维素酶的加入对纤维素酶解效率的提高具有很好的促进作用。

图3 添加半纤维素酶后甘蔗渣底物酶解液的糖质量浓度(a)和酶解率(b)的变化

3 结 论

3.1考察了3种DES，包括 ChCl/G、ChCl/U、ChCl/EG(物质的量比均为2∶1)对甘蔗渣酶解过程的影响，结果表明：DES添加量为1%时对酶解效率的影响较小，当DES添加量提高至5%，糖质量浓度和酶解率受到轻微抑制。

3.2摇床和磁力搅拌2种混匀方式，对最终的纤维素酶解率影响不大，但磁力搅拌反应中葡萄糖质量浓度较摇床更高，混匀方式仅仅只加快了酶解速率，但不改变酶解程度。

3.3分批补料酶解过程选取150 g/L的甘蔗渣底物为初始质量浓度，在12和36 h分别补料100 g/L，酶解96 h总糖质量浓度为162.7 g/L，纤维素和半纤维素酶解率均为51%。

3.4半纤维素酶的添加对甘蔗渣酶解有很好的促进作用，酶解96 h后总糖质量浓度提高至218.9 g/L，葡萄糖和木糖的质量浓度较未添加半纤维素酶时分别提高45%和21%，纤维素和半纤维素酶解率分别提高至72%和63%。