超高效液相色谱-串联质谱法测定柴胡中4种成分的含量

郭宇鸽，柏玉冰，李洪权，胡冠羽，黎旭*（.湖南中医药大学第一附属医院，长沙 40007；.长沙市第三医院，长沙 4005；.株洲市食品药品检验所，湖南 株洲 4000）

柴胡是伞形科（Apiaceae）植物北柴胡（Bupleurum chinenseDC.）的干燥根。其性味辛、苦，微寒，归肝、胆、肺经，具有疏散退热，疏肝升阳，升举阳气等功效[1]。柴胡主要含有皂苷[2]、挥发油[3]、黄酮[4]、多糖[5]、香豆素、多炔[6]等成分，具有解热、调节免疫[7]、抗抑郁[8]、保肝[9]、抗肿瘤[10]、抗炎[11]等作用。

目前，柴胡所有药理作用中，研究最典型的是解热作用。有研究认为，其作用成分主要为直接产生解热作用的柴胡皂苷和挥发油以及通过抑制热源而间接产生解热作用的黄酮[12-13]。也有研究者认为，柴胡的传统用药方式为煎煮，此时，挥发油含量不足以达到解热效果[14]，因此，柴胡发挥解热作用的成分应该以柴胡皂苷和黄酮为主。而柴胡中各种柴胡皂苷和黄酮含量有差异，含量较高者为柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、芦丁以及槲皮素[15-17]。目前，关于同时测定含这4种成分含量的方法，只有液相色谱法[18]。而相对液相色谱法，具有信号采集时间短，选择性强等优势[19]的液相色谱-串联质谱法尚未见报道。

本文基于超高效液相色谱-串联质谱（UPLCMS/MS）法建立柴胡中4种成分的含量测定方法，以期更好地控制其质量。

1 材料

1.1 试药

柴胡样品源自于药店、网商和药材市场，信息见表1。所有批次药材经株洲市食品药品检验所胡冠羽主管药师鉴定均为伞形科（Apiaceae）植物北柴胡（Bupleurum chinenseDC.）的段根。柴胡皂苷a（批号：110777-201711，纯度：98.0%）、柴胡皂苷d（批号：110778-201711，纯度：98.0%）、槲皮素（批号：100081-200907，纯度：97.4%）和芦丁（批号：10080-200707，纯度：90.5%）对照品（中国食品药品检定研究院）。

表1 样品信息Tab 1 Sample information

甲酸、乙酸铵（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，霍尼韦尔有限公司）。

1.2 仪器

XSE 205DV型电子天平（精度：0.01 mg，梅特勒托利多仪器有限公司）；HNS-SY-150型超声波仪（北京恒奥德仪器仪表有限公司）；Agilent 1290 Infinity Ⅱ型超高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；QTRAP 4500型三重四极杆质谱（上海爱博才思分析仪器有限公司）等。

2 方法与结果

2.1 色谱-质谱条件

2.1.1 色谱条件 采用Welch Utimate AQ-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）色谱柱，以水（A）-乙腈（B）为流动相，梯度洗脱（0～5 min，90%→55%A；5～10 min，55%→30%A；10～12 min，30%→10%A；12～12.5 min，10%→90%A；12.5～15 min，90%A），流速0.5 mL·min－1，采集时间15 min，柱温30℃，进样量5 μL。

2.1.2 质谱条件 质谱：电喷雾电离源（ESI），负离子扫描，多反应监测（MRM），离子源温度：550℃，电喷雾电压：－4500 V，气帘气：35.0 psi，离子源气1：55 psi，离子源气2：55 psi，碰撞气：氩气。各成分的质谱参数见表2，准分子离子见图1。

图1 4种成分的准分子离子图Fig 1 Excimer ion of 4 components

表2 4种成分的保留时间及质谱参数Tab 2 Retention time and UPLC-MS/MS parameters of the 4 components

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品储备液 精密称取柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、槲皮素和芦丁对照品适量，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得。经含量折算后，上述各对照品的质量浓度分别为1.0094、1.0388、0.983 74、0.977 40 mg·mL－1。对照品提取离子色谱图见图2A。

2.2.2 供试品溶液 取柴胡粉末（粉碎后过4号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇30 mL，称量，超声（400 W，40 kHz）提取30 min，静置至室温，再称量，用70%甲醇补足减失的量，摇匀，精密量取1 mL摇匀后的溶液，置于10 mL量瓶中，加入70%甲醇定容至刻度线，再次摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液，注入质谱仪进行分析。柴胡样品提取离子色谱图见图2B。

图2 柴胡混合对照品和样品中分析物提取离子色谱图Fig 2 Extracted ion chromatogram of Bupleurum chinense DC.mixture reference and sample

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 精密量取混合对照品储备液适量，用70%甲醇稀释得系列混合对照品溶 液（柴胡皂苷a：100.940、504.700、1009.40、2018.80、4037.60、5047.00 ng·mL－1；柴胡皂苷d：103.880、519.400、1038.80、2077.60、4155.20、5194.00 ng·mL－1；槲 皮 素：4.918 70、24.5935、49.1870、98.3740、196.748、245.935 ng·mL－1；芦丁：122.175、610.875、122 1.75、244 3.50、488 7.00、610 8.75 ng·mL－1），进样测定，以质量浓度X（ng·mL－1）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，计算4种成分的线性回归方程，结果见表3，4种成分在各自线性范围内呈良好的线性关系。

表3 线性关系结果(n＝6)Tab 3 Linear regression (n＝6)

2.3.2 精密度试验 取混合对照品溶液，按照“2.1”项下条件连续进样6次，记录各成分峰面积并计算RSD。结果柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、槲皮素和芦丁峰面积的RSD分别为0.96%、0.79%、1.1%和1.2%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验 取同一批样品（批号：CH20210314-1）6份，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，记录各成分峰面积并计算RSD。结果柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、槲皮素和芦丁峰面积的RSD分别为1.3%、1.3%、1.4%和1.2%，表明该方法重复性良好。

2.3.4 稳定性试验 取同一批样品供试品溶液（批号：CH20210314-1），分别于0、2、4、8和12 h进样分析，记录各成分峰面积并计算RSD。结果柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、槲皮素和芦丁峰面积的RSD分别为1.7%、2.0%、1.5%和1.7%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.3.5 加样回收试验 取已知含量的样品（批号：CH20210314-1）6份，每份约0.25 g，精密称定，分别加入绝对含量接近0.25 g药材所含量的对照品溶液后，按“2.2.2”项下方法制备，进样分析，计算加样回收率，结果柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、槲皮素和芦丁的平均加样回收率为98.74%、97.96%、97.97%和98.41%，RSD均小于1.5%，表明本方法回收率良好。

2.4 样品测定

精密称取6批次不同批号的柴胡各2份，分别按照“2.2.2”项下方法制备，按照“2.1”项下条件进样测定，代入线性回归方程，计算4种成分的含量，结果见表4。

表4 6批次样品的4种成分的含量(μg·g－1，n＝2)Tab 4 Contents of 4 components in 6 batches of samples(μg·g－1，n＝2)

3 讨论

3.1 供试品溶液制备条件优化

本研究比较了不同提取溶剂（30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇和90%甲醇），不同提取体积（20、30、40和50 mL），不同提取时间（10、20、30和40 min）对供试品溶液制备的影响，以4种成分的峰面积大小为判断依据，确定最佳条件。结果，当甲醇浓度为70%，提取体积为30 mL，提取时间为30 min时，各成分峰面积均为最大值，因此选为最佳制备条件。

3.2 色谱条件优化

本研究比较了4种流动相组成（甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液和乙腈-含5 mmol·L－1乙酸铵的0.1%甲酸水溶液），4种C18色 谱 柱（Agilent Eclipse XDB、Thermo Acclaim 120、Welch Xtimate和Welch Utimate AQ，规格：4.6 mm×150 mm，5 μm），2种洗脱程序[乙腈-水（40∶60）等度洗脱和梯度洗脱（详见本文色谱条件）]，3种流速（0.3、0.5和0.7 mL·min－1）。结果，流动相组成为甲醇-水溶液时，各成分的峰稍有拖尾现象，水相加入乙酸铵各成峰面积被抑制；加入乙腈-水，拖尾得到改善，峰宽较窄；加入甲酸，无明显变化，因此，乙腈-水为最佳流动相组成。4种色谱柱均得到良好的峰形和分离度，但是Welch Utimate AQ柱相对其他色谱柱，各成分峰宽更窄，峰形更为尖锐，保留性更好，因此选为最合适色谱柱。洗脱程序中，等度洗脱时各成分峰形均有拖尾，换成梯度洗脱，峰形得到改善，因此选为最佳洗脱程序。流速为0.3和0.5 mL·min－1时，各成分峰形、峰面积相当；但是当流速为0.3 mL·min－1时出峰慢，不利于提高分析效率；当流速为0.7 mL·min－1时，各成分离子化不充分，峰面积变小，因此，选择0.5 mL·min－1为最佳流速。

3.3 质谱参数的建立

通过比较正、负离子模式下各成分分子离子峰信号强度，选择负离子模式；根据信号强度曲线，选择各成分分子离子峰信号最强时所显示数值；离子源温度、电喷雾电压、气帘气及离子源气等参数则选择仪器默认参数。

3.4 方法优劣比较

目前对柴胡中皂苷和黄酮成分进行定量分析的方法有多种，如HPLC-DAD（二极管阵列检测器）、HPLC-ELSD（蒸发光散射检测器）等。相对而言，本法优势明显，主要体现在快速、选择性强等方面。如郭司群等[20]测定柴胡皂苷d的时长达到60 min，韦英杰等[18]同时测定柴胡中皂苷和黄酮成分的时长更是达到70 min，而本法只需15 min。另外，李卫斌等[21]测定柴胡皂苷含量时，柴胡皂苷c与杂峰分离不彻底，有部分重叠。韦杰英等[18]采用的方法中，柴胡皂苷a峰也与杂峰有重叠，影响到皂苷成分定性定量的准确性，而本法除色谱柱的分离功能，还可根据分析物的不同质荷比具有二次分离功能，专属性强，干扰少。但是，本法设备比较昂贵，可能在前期投入和方法推广方面不如上述方法。

3.5 总结

本研究建立了柴胡中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、槲皮素和芦丁4种成分的超高效液相-串联质谱含量测定方法，为基于这4种成分对柴胡进行解热的量效关系评价提供了研究基础。