1-脱氧野尻霉素对高脂饮食联合链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠的血糖和内质网应激通路的影响

周碧兰，彭电，曾慧，李海刚（.长沙卫生职业学院药学院，长沙 40600；.长沙医学院新型药物制剂研发湖南省重点实验室，长沙 409）

糖尿病是一种由胰岛素分泌或作用缺陷所引起的以高血糖为重要特征的慢性疾病，主要分为1型和2型[1]。近年来，糖尿病患病率逐年增加，并呈现年轻化的趋势，国际糖尿病联合会统计的数据显示2017年全球大约有4.15亿糖尿病患者，2045年将超过6.29亿[2-4]。糖尿病患者由于糖代谢紊乱易导致糖尿病肾病、视网膜病变、糖尿病足等一系列并发症的发生，严重影响患者生存率[5-7]。

研究证实，糖尿病患者体内的胰岛β细胞数量的减少是导致其胰岛功能受损的重要原因，其与β细胞内发生的内质网应激反应密切相关[8]。内质网是蛋白质合成和加工的重要细胞器，当合成新蛋白质的需求与内质网促进蛋白质成熟和转运的能力失去平衡之后，易导致内质网应激的发生，而在胰岛β细胞中，存在着高度发达的内质网系统[9]，尤其是在2型糖尿病患者体内的胰岛β细胞中，由于发生胰岛素抵抗，机体内代偿性胰岛素分泌增多，增加了内质网的负担，并且存在高游离脂肪酸和高糖的刺激，从而诱导了β细胞发生内质网应激反应甚至凋亡[10]，因此，严重的内质网应激是加剧糖尿病胰岛损伤的一个重要机制，积极研发具有减轻胰岛β细胞内质网应激进而减轻胰岛损伤作用的新型控糖药物，对于改善糖尿病患者的生活质量具有十分重要的意义，也能为糖尿病患者提供更多的用药选择。

1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）是一种多羟基生物碱成分，存在于桑叶、鸭跖草、风信子和沙参属等植物中，也可从微生物链霉菌和芽孢杆菌中分离得到[11-12]。近年来，多项研究结果表明DNJ具有抑制糖代谢紊乱的作用[13-15]，但DNJ在糖尿病模型鼠中是否能降低血糖水平、减轻胰岛组织损伤并改善胰岛素抵抗值得我们探究，由于内质网应激可诱导胰岛细胞损伤后进一步引起糖尿病恶化，本研究将进一步探讨DNJ对糖尿病的作用是否与调控内质网应激反应及其下游通路蛋白水平有关。

1 材料

1.1 实验动物

实验动物C57BL/6小鼠，雄性，鼠龄5～6周，40只，体质量（18±4）g [南京大学模式动物研究所]。小鼠购入后在动物房适应性喂养1周，严格遵守动物管理条例，按照标准条件饲养[动物房温度（25±3）℃；相对湿度50%～65%]。昼夜节律照明，并给予小鼠自由饮水和适量的饲料。

1.2 试药与仪器

DNJ、链脲佐菌素（STZ）、4%多聚甲醛固定液和胰岛素ELISA检测试剂盒（美国Sigma公司）；盐酸二甲双胍片（浙江亚太药业股份有限公司）；血糖仪和血糖试纸（美国强生公司）；β-actin、p-PERK、p-eIF2α、IRE1α、p-JNK等抗体和HRP标记的二抗（美国Cell Signaling Technology公司）；胰岛素注射液（江苏万邦生化医药股份有限公司）；葡萄糖（阿拉丁试剂有限公司）；水合氯醛（上海尚宝生物科技有限公司）；HE（苏木精-伊红）染色试剂盒（武汉赛维尔生物科技有限公司）；高脂饲料（南通特洛菲饲料科技有限公司，主要成分为面粉、麸皮、玉米、豆粕、玉米、食盐、氨基酸、猪油、蔗糖、胆固醇、各种维生素及微量元素等）；彼爱姆BM-38XD倒置荧光显微镜（南京东迈科技仪器有限公司）；酶标仪（Thermo Scientific公司）；台式高速制冷离心机（上海圣科仪器设备有限公司）。

2 方法

2.1 小鼠分组给药及血糖、体质量测定

选取30只正常的雄性C57BL/6小鼠建立糖尿病模型，在高脂饲料连续喂养4周后，小鼠空腹过夜，每日腹腔注射诱导剂STZ（35 mg·kg－1），连续1周。另选10只正常组小鼠普通饲料喂养4周后每日腹腔注射同等剂量的柠檬酸盐缓冲液（pH 4.4），连续1周。各组小鼠连续注射一周后尾静脉采血法检测小鼠血糖浓度，若连续3 d随机检测到的小鼠血糖水平值均大于16.7 mmol·L－1，则认为糖尿病造模成功。将造模成功的小鼠随机分成糖尿病组（DM组，生理盐水）、二甲双胍组（MFM组，300 mg·kg－1）、1-脱氧野尻霉素组（DNJ组，60 mg·kg－1），并另设正常对照组（NC组，生理盐水），四组小鼠每日灌胃给药一次，在给药的第0、7、14、21和28日分别用血糖仪和试纸测定各组小鼠血糖水平，并称量各组小鼠体质量。

2.2 口服葡萄糖耐量实验和腹腔注射胰岛素耐受实验

在药物干预的第28日进行口服葡萄糖耐量实验（OGTT）：将各组小鼠禁食不禁水处理过夜，次日10点灌胃给予质量浓度为0.2 g·mL－1的葡萄糖溶液（2 g·kg－1，t＝0 h）。在药物干预的第29日进行腹腔注射胰岛素耐受实验（IPITT）：将各组小鼠禁食不禁水处理4 h，腹腔注射0.05 U·mL－1的胰岛素溶液（0.5 U·kg－1，t＝0 h）。以上两项操作完成后分别在t＝0 h和给予葡萄糖或者胰岛素后0.25、0.5、1、1.5、2 h时尾静脉取血检测各个时间点的血糖值，并计算曲线下面积（AUC）。

2.3 胰岛素水平测定

腹腔注射10%的水合氯醛（300 mg·kg－1）对各组小鼠进行麻醉，待小鼠失去知觉和行动能力后再用手术剪剪开小鼠胸腔，采用5 mL注射器进行心脏取血，并将全血标本转移至含有EDTA的抗凝管中，再在冷冻离心机中以3000 r·min－1离心5 min，吸取上清得到待测的血浆样品。随后按照胰岛素ELISA检测试剂盒中的步骤进行操作，用酶标仪检测各组小鼠血浆样品在450 nm波长处的吸光度值，并依据胰岛素标准曲线计算各组小鼠血浆中胰岛素的水平。

2.4 胰腺组织的苏木精-伊红染色

将各组实验小鼠解剖后，取小鼠胰腺的部分胰尾组织，用4%的多聚甲醛溶液进行固定后用石蜡包埋切片，再用苏木精和伊红染料进行染色，然后用显微镜观察胰腺组织的形态，胰岛的横断面面积用Image Plus 6.0软件分析。

2.5 Western blot法检测IRE1α和PERK通路中相关蛋白的表达水平

将各组小鼠的胰腺组织用RIPA裂解后再超声破碎，4℃5000 r·min－1离心10 min，吸取上清溶液用BCA法测定蛋白质含量后，配制适宜浓度的SDS-PAGE胶进行Western blot实验，分别检测IRE1α和PERK通路中相关蛋白表达水平的变化。

2.6 统计学检验

实验数据用平均值±标准差（±s）表示。数据采用SPSS软件进行分析，两组间比较采用独立样本t检验，多组比较采用单因素方差分析，若P＜0.05说明差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 DNJ对糖尿病小鼠体质量的影响

造模前，各组小鼠体质量无差异，而造模成功后，随着周龄的增加，正常对照组小鼠体质量逐渐增加，而糖尿病组小鼠体质量增长缓慢，与正常对照组小鼠相比较有减轻的趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。与糖尿病组小鼠比较，灌胃给予二甲双胍的第14、21和28日，可产生延缓糖尿病小鼠体质量增长的作用（P＜0.05），但灌胃给予DNJ的小鼠体质量变化不明显（P＞0.05），见表1。

表1 不同组小鼠体质量变化情况(±s)Tab 1 Changes in body mass of mice in different groups (±s)

表1 不同组小鼠体质量变化情况(±s)Tab 1 Changes in body mass of mice in different groups (±s)

注：与DM组比较，＊P＜0.05。Note：Compared with the DM group，＊P＜0.05.

组别 例数 造模前体质量/g 造模后体质量/g 0日 7日 14日 21日 28日NC组 10 13.2±0.1 25.9±0.3 26.3±0.2 26.9±0.6 27.3±0.8 27.8±0.4 DM组 8 12.9±0.3 23.1±0.4 24.6±0.1 25.4±0.3 25.6±0.5 26.4±0.3 MFM组 10 13.1±0.2 22.9±0.3 22.6±0.4 22.5±0.2＊ 22.3±0.4＊ 22.2±0.1＊DNJ组 9 13.0±0.3 22.8±0.2 23.1±0.5 22.9±0.1 23.4±0.2 23.8±0.6

3.2 DNJ对糖尿病小鼠血糖和胰岛素水平的影响

正常对照组小鼠的血糖随鼠龄增加而稳定，始终低于11.1 mmol·L－1，而糖尿病组小鼠的血糖水平明显高于正常对照组小鼠（P＜0.05）。与糖尿病组小鼠相比，在灌胃给予阳性药物二甲双胍第7、14、21、28日后，小鼠血糖水平明显下降，血糖下降幅度随着给药时间的增加而有所增大（P＜0.05）。DNJ组小鼠的血糖在第0、7和14日时与糖尿病组相比差异无统计学意义，而在第21日和28日时血糖水平明显低于糖尿病组小鼠（P＜0.05，见图1A）。

在高脂饮食联合STZ诱导的2型糖尿病鼠内，由于存在胰岛素抵抗导致其促葡萄糖分解代谢的作用减弱，促使胰岛素代偿性分泌增多以维持血糖浓度相对稳定。由图1可知，糖尿病组小鼠的胰岛素水平也明显高于正常组小鼠，给予二甲双胍或DNJ后都能降低糖尿病小鼠的胰岛素水平，在一定程度上改善糖尿病小鼠的胰岛素抵抗（P＜0.05，见图1B）。

图1 DNJ对糖尿病小鼠血糖和胰岛素水平的影响Fig 1 Effect of DNJ on blood glucose and insulin levels in diabetic mice

3.3 DNJ对糖尿病小鼠OGTT和IPITT的影响

在OGTT实验中，分别灌胃2 g·kg－1葡萄糖后，各组小鼠在0.25 h时的血糖水平较0 h时显著升高（P＜0.05，见图2A）。正常对照组小鼠的血糖水平在餐后1 h时明显恢复，并在2 h时接近正常水平，但糖尿病组小鼠的血糖在餐后2 h仍维持在较高的水平，糖耐量水平异常。二甲双胍组小鼠在口服葡萄糖后的血糖水平较模型组小鼠显著降低（P＜0.05），而DNJ组小鼠在餐后0.25 h和0.5 h的血糖水平与糖尿病组小鼠相比差异无统计学意义，但从餐后1 h开始的血糖值明显低于糖尿病组小鼠，并在餐后2 h时接近于餐前水平（P＜0.05）。从各组小鼠血糖随时间变化曲线的面积值情况来看，糖尿病组小鼠的AUC较正常对照组小鼠明显增大，而二甲双胍组小鼠的AUC面积较糖尿病组小鼠显著下降，DNJ也能在一定程度上恢复糖尿病小鼠的糖耐量水平（P＜0.05，见图2B）。

在IPITT实验中，各组小鼠在注射胰岛素后的0.25 h达到血糖最低值，在0.5 h有小幅度回升，在1～2 h这段时间内基本恢复到原有水平。糖尿病组小鼠在注射胰岛素后的血糖水平明显高于正常对照组小鼠，给予二甲双胍或DNJ后，小鼠血糖水平较糖尿病小鼠有所降低（P＜0.05，见图2C）。从IPITT的AUC图中可知，糖尿病组小鼠的AUC明显大于正常对照组，出现了胰岛素不耐受的表现，而二甲双胍和DNJ均能降低糖尿病小鼠的AUC（P＜0.05，见图2B），这说明二甲双胍和DNJ能增加糖尿病小鼠对胰岛素的敏感性。

图2 DNJ对糖尿病小鼠OGTT和IPITT的影响Fig 2 Effect of DNJ on OGTT and IPITT in diabetic mice

3.4 DNJ改善糖尿病小鼠胰岛损伤

HE染色观察各组小鼠胰腺组织中胰岛部分的形态病理学改变，与正常对照组小鼠相比，糖尿病组小鼠的胰岛分布稀疏，胰岛数量和面积明显减少。由图3可知，二甲双胍组小鼠的胰岛形态和分布比糖尿病小鼠的更加规则，胰岛面积有所增加。DNJ也能增加糖尿病小鼠的胰岛面积，改善糖尿病小鼠的胰岛损伤。

图3 不同组小鼠胰腺组织HE染色图Fig 3 HE staining of pancreatic tissue of mice in different groups

3.5 DNJ调控糖尿病小鼠IRE1α和PERK通路中相关蛋白表达水平

由图4可知，糖尿病小鼠胰腺组织中的IRE1α蛋白水平明显上调，给予药物二甲双胍或DNJ后都能明显下调IRE1α蛋白的表达。与正常对照组小鼠相比，糖尿病小鼠胰腺组织中的IRE1α蛋白通路中的下游蛋白JNK的磷酸化水平显著升高。与糖尿病组小鼠相比，二甲双胍组和DNJ组小鼠胰腺组织中的p-JNK蛋白水平均明显降低（P＜0.05，见图4A和4B）。

与正常对照组小鼠相比，糖尿病小鼠胰腺组织中的p-PERK和p-eIF2α蛋白表达水平显著性升高。给予二甲双胍后，p-PERK和p-eIF2α的蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05）。与糖尿病组小鼠相比，DNJ也能抑制小鼠胰腺组织中p-PERK和p-eIF2α的高表达（P＜0.05，见图4C和4D）。

图4 DNJ对糖尿病小鼠IRE1α和PERK通路蛋白表达的影响Fig 4 Effect of DNJ on the expression of the IRE1α and PERK pathways in diabetic mice

4 讨论

糖尿病是一种以多饮、多食、多尿和体质量减轻等症状表现为主的代谢性疾病，患者体内持续的高血糖易损伤其心血管和神经系统，导致心脑血管疾病、肾病、视网膜病等并发症的发生[16]。目前我国已成为糖尿病大国，且2型糖尿病占糖尿病总体人群的90%以上[4]，研发新型控糖药物对于改善糖尿病患者的生活质量具有十分重要的意义。本研究采用化学诱导剂STZ联合高脂食物喂养诱导小鼠发生2型糖尿病，探讨DNJ对糖尿病的影响及可能的作用机制。本课题组的研究与以往关于DNJ的降糖作用研究所用动物模型有一定区别，研究结果也有所不同，以往关于DNJ的研究主要集中在其对STZ诱导的1型糖尿病模型鼠、基因突变型糖尿病鼠、糖尿病肾病大鼠的作用。如Hu等[17]研究发现从桑叶中提取分离的DNJ能改善STZ诱导的1型糖尿病模型鼠的葡萄糖代谢和肠道微生物群水平。另一项研究则表明桑叶中DNJ能有效抑制分解糖类酶的活性，阻止葡萄糖的吸收[13]。姚佳等[18]研究发现DNJ还具有降低糖尿病肾病大鼠的血糖和减轻肾损伤的作用。本课题组的研究结果表明DNJ在给药的第7日和14日对小鼠血糖无影响，但在第21日和28日时能显著下调糖尿病小鼠的血糖水平，DNJ对糖尿病小鼠的体质量无明显作用，造成这一情况的原因可能是DNJ是一种生物碱成分，起效较缓慢。在给药结束后，我们对小鼠血液中的胰岛素水平进行测定，研究结果表明糖尿病小鼠体内由于存在胰岛素抵抗导致胰岛素代偿性的分泌增加[14，16]，二甲双胍和DNJ都能降低糖尿病小鼠的胰岛素抵抗，这说明了胰岛素作为机体内唯一的降血糖激素，在维持糖尿病小鼠血糖稳态方面发挥了重要作用。糖尿病患者存在糖代谢紊乱和胰岛素不耐受的情况，课题组通过OGTT实验和IPITT实验发现DNJ能改善糖尿病小鼠的糖耐量，增加小鼠对胰岛素的敏感性，在延缓糖尿病进程方面具有重要意义。

近年来有研究结果表明DNJ可通过不同机制改善血糖水平或胰岛素抵抗。如Li等[19]研究发现DNJ通过调控IR-GlUT4和 ADIPO-GLUT4通路维持3T3-L1脂肪细胞内的葡萄糖稳态水平。Liu等[20]研究发现DNJ通过激活PI3K/AKT通路减轻db/db 型糖尿病小鼠的胰岛素抵抗。在2型糖尿病患者的胰岛β细胞内由于发生胰岛素抵抗，机体内代偿性胰岛素分泌增多，增加了内质网的负担，此时内质网中的分子伴侣蛋白结合这些代偿性产生或错误折叠的蛋白质如胰岛素，使IRE1α、PERK等蛋白被释放并磷酸化而激活，进而使得它们的下游信号通路蛋白如JNK、eIF2α等被激活，从而诱发胰岛β细胞发生凋亡[21-22]。IRE1α-JNK通路的下调有助于内质网的稳态，减轻内质网应激反应[23]，此外，PERK-eIF2α信号通路的调控可选择性地减少蛋白质的翻译，进而阻止新合成的蛋白质进入内质网从而减轻内质网的压力[24]，因此本课题组检测了DNJ对IRE1α、p-JNK、p-PERK蛋白和下游效应器p-eIF2α蛋白表达的影响，结果表明糖尿病小鼠胰腺组织中内质网应激反应相关蛋白IRE1α、p-JNK、PERK和eIF2α的表达水平明显升高，给予药物DNJ可下调这些蛋白的表达，说明内质网应激可导致胰岛损伤，与糖尿病的发生发展密切相关，而DNJ可减轻内质网应激反应，改善2型糖尿病小鼠的胰岛损伤。

5 结论

本研究表明DNJ可通过下调糖尿病小鼠胰腺组织中IRE1α、p-JNK、PERK和eIF2α蛋白的表达，进而减轻内质网应激反应，发挥降低2型糖尿病小鼠血糖、改善胰岛素抵抗和减轻小鼠胰岛损伤的作用（见图5）。

图5 DNJ对糖尿病小鼠的作用和作用机制Fig 5 Effect and mechanism of DNJ on diabetic mice