两类紫云英苗菜生长过程中酚类物质及其抗氧化活性的变化

赵齐燕，唐宁，贾鑫，程永强

（植物源功能食品北京市重点实验室，中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083）

紫云英（L.）是豆科黄耆属二年生草本植物，紫云英多作为绿肥、蜜源植物和牧草栽培使用，但种植效益不高。紫云英较其他绿肥含有更多的羧酸和类蛋白质成分，其花蜜总抗氧化性高于金合欢等花源蜂蜜，嫩梢富含抗坏血酸，且有毒有害物质含量均符合国家标准。可见，紫云英在安全、营养两方面都具备成为绿色蔬菜品种的潜力。2014 年，何春梅等开发了菜肥兼用的紫云英高效种植施肥技术。2020 年初，浙江省尝试综合开发紫云英的绿肥、饲料、菜用、景观、蜜用功能，富阳、临安、奉化等地部分农户把紫云英作菜用种植，经济效益非常可观。在此基础上，季卫英等筛选出了适合种植在浙江地区的菜用紫云英品种。由此可见，菜用紫云英的开发利用、发掘紫云英的经济效益是大势所趋。

芽苗菜，也称活体蔬菜，生育期短、品质脆嫩、营养丰富。大量研究显示，豆科种子发芽后，营养水平和抗氧化水平都有显著提升：绿豆发芽3 d 后抗坏血酸含量增长2.7 倍，咖啡酸、儿茶素、阿魏酸、没食子酸和芦丁等酚类化合物逐渐增加；大豆发芽3 d 后异黄酮含量高达4.68 mg/g 干样，豆芽中染料木黄酮、大豆苷元、总糖苷配基分别增加了3、2.4 和2.5 倍；豇豆发芽5 d 后总酚含量增加了1.7倍，抗氧化活性增加了2.8 倍，叶酸含量也有所增加。且萌发后豆类中的脂肪、碳水化合物、蛋白质等大分子物质会水解成氨基酸、寡糖等小分子物质，更易被人消化吸收，抗炎、抗菌、抗氧化性增强，营养价值提高。抗营养因子如棉子糖、水苏糖含量在发芽后也会显著降低，避免胀气。水培活体蔬菜能够提升活性物质含量与抗氧化能力，且清洁、健康、快速，符合当代生活节奏与绿色消费需求，是开发功能食品的理想方法。

紫云英产量高，营养丰富，易于生长，因此非常适合做芽苗菜开发。但到目前为止，关于其成分的研究较少，且紫云英的菜用价值还未被开发利用。本文在对比分析紫云英湖南种子与安徽种子的基本营养成分的基础上，水培开发苗菜，对比分析两产地苗菜总酚、总黄酮含量以及酚类物质组成并进行DPPH、ABTS 抗氧化评价，获得苗菜发芽过程中的物质变化规律并优化芽菜培育工艺，以期拓宽菜用紫云英的资源化利用渠道，为提高紫云英经济效益提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

湘紫1 号 资阳区晟昱紫云英种植专业合作社；皖紫1 号和紫云英土培成熟茎叶（4 月25 日至5 月10 日播种，8 月25 日采摘）芜湖青弋江种业有限公司；原儿茶酸（≥98%）、香草酸（≥98%）、绿原酸（≥98%）、对香豆酸（≥98%）、没食子酸（≥98%）、槲皮素（≥98%）、阿魏酸（≥98%）、芦丁（≥98%）、儿茶素（≥98%）、芥子酸（≥98%）、肉桂酸（≥98%）、表儿茶素（≥98%）索莱宝；芹菜素（≥98%）、山奈酚（≥98%）、丁香酸（≥98%）、水杨酸（≥98%）ANPEL Laboratory Technologies Inc.（Shanghai,China）；对羟基苯甲酸（99.5%）、木犀草素（≥98%）ZZSTANDARD 甄准生物；ABTS（Ultra-Pure）AMRESCO；DPPH（>97%）东京化成工业株式会社；其他实验试剂 均为国产分析纯。

SMP500-15275-SWXN 型酶标仪 Molecular Devices；T6 NG 型分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；KDY-9820 型半自动凯氏定氮仪 北京市通润源机电技术有限责任公司；PRx-450C 型智能培养箱 宁波赛福实验仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 紫云英种子基本成分的测定 参考国标GB 5009.3-2016 中的直接干燥法、GB 5009.5-2016 中的凯氏定氮法、GB 5009.9-2016 中的酶水解法、GB 5009.6-2016 中的索氏抽提法、GB/T 5009.10-2003 中的酸碱消煮法、GB/T 5009.4-2016 中的高温灰化法测量湘紫1 号、皖紫1 号种子水分、蛋白质、淀粉、粗脂肪、粗纤维、总灰分含量。

1.2.2 紫云英苗菜的开发 浸种方法参考Mastropasqua 等的方法。用超过紫云英种子体积1 倍的1.05%～1.10%（体积分数）的盐水室温避光浸种2 h，清水洗净后用适量0.1%（体积分数）的次氯酸钠浸泡种子半小时，用蒸馏水洗至中性。将处理过的紫云英种子均匀播种于发芽盘中，温度25 ℃、湿度80%黑暗培养3 d 后于光照80%的培养箱中发芽育苗，于发芽8、10、14 d 取样测定酚类组成、总酚和总黄酮含量以及抗氧化能力，以土培成熟茎叶为对照。

1.2.3 酚类物质的提取 参考钟少杰等的方法并稍作修改。用蒸馏水冲洗苗菜，50 ℃、12 h 烘干，粉碎密封备用。称取0.5 g 该干燥粉末于150 mL 锥形瓶中，用体积分数31%乙醇以1:41 的料液比于73 ℃超声提取106 min，抽滤取上清液，定容在25 mL 容量瓶中，用0.22 μm 滤膜过滤后储存在小棕瓶中，−20 ℃备用。

1.2.4 总酚、总黄酮含量测定 总酚测定参考Folin-Ciocalteu 法，取醇提液100 μL，加入500 μL 福临酚溶液，摇匀，再加400 μL 7.5% NaCO溶液，放入37 ℃培养箱中1 h 后，在765 nm 下测定吸光值，以没食子酸标准品绘制标准曲线，结果以每克样品中没食子酸当量（gallic acid equivalents，GAE）表示测定样品（干物质）中的总酚含量。标准曲线方程为y=4.9012x+0.1193，=0.9932。

总黄酮测定参考黄酮沉淀法，取醇提液500 μL，加入500 μL 的20%盐酸溶液和250 μL 37%甲醛溶液，摇匀，放在暗处静置24 h。之后取出1 mL 于离心管中离心（12000 r/min，10 min），除去白色沉淀，上清备用。每个再分别加入500 μL 福临酚溶液，摇匀，再加400 μL 7.5% NaCO溶液，放入37 ℃培养箱中1 h 后，在765 nm 下测定吸光值，以没食子酸标准品绘制标准曲线计算滤液中总酚含量，总酚含量减去滤液总酚含量即为总黄酮含量，结果以每克样品中没食子酸当量（gallic acid equivalents，GAE）表示测定样品（干物质）中的总黄酮含量。

1.2.5 酚类成分测定 色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相：流动相A 为乙腈，流动相B 为0.05%甲酸水溶液，梯度洗脱程序见表1；流速为0.3 mL/min；柱温：30 ℃；进样量为5 μL；自动进样器温度为20 ℃；负离子模式下，毛细管电压2.90 kV，离子源温度120 ℃，脱溶剂气温度400 ℃，锥孔气（N）流速50 L/h，脱溶剂气（N）流速600 L/h，碰撞气（Ar）流速0.07 mL/min。正离子模式下，毛细管电压3.10 kV，其余条件与负离子模式相同。结果以mg/g DW 表示。

表1 UPLC 洗脱程序Table 1 Elution program of UPLC

1.2.6 DPPH 自由基清除率的测定 参考Koodkaew的方法。用乙醇配制0.1 mmol/L DPPH 溶液，避光保存备用。取96 孔板，每孔加入180 μL DPPH 溶液和紫云英醇提液溶液20 μL，振荡混匀后，室温避光放置15 min，于517 nm 波长处测定吸光度。以Trolox 溶液作为阳性对照，结果以Trolox 当量（mmol TE/L）和IC（mg/mL）表示。DPPH 自由基清除率按式（1）计算。

式中：A为样品吸光度；A为用无水甲醇代替DPPH 同法测定吸光度；A为以样品溶剂溶剂即31%乙醇代替样品同法测定吸光度。

1.2.7 ABTS自由基清除率的测定 参考Islam 等的方法。取7 mmol/L 的ABTS 与1.4 mmol/L 的过硫酸钾溶液等体积混合均匀，避光室温放置16 h，临用前用95%乙醇溶液以1:40 体积比将混合液在734 nm 下的吸光值调整为0.7±0.02，得ABTS 工作液。取工作液5 mL、紫云英苗菜醇提液0.5 mL，混合均匀，反应6 min 后用分光光度计于734 nm 波长处测定吸光度。以Trolox 溶液为阳性对照，结果以Trolox 当量（mmol TE/L）和IC（mg/mL）表示。ABTS自由基清除率按式（2）计算。

式中：A为样品吸光度；A为以溶剂即31%乙醇代替样品同法测得的吸光度。

1.3 数据处理

运用Excel 2013 整理各指标的测定结果，采用SPSS 25.0 进行差异性分析和相关性分析，每个处理重复3 次，用Origin 2021 作图。

2 结果与分析

2.1 紫云英种子基本成分

蛋白质是紫云英种子的优势成分，湘紫1 号和皖紫1 号种子蛋白质含量分别为33.22%±0.62%和38.66%±0.41%。豆科植物蛋白质含量丰富，但不同豆类的蛋白质含量差异较大。大豆蛋白含量相对较高，约为33.1%～49.2%，绿豆中含蛋白质14.6%～33.0%，鹰嘴豆为17%～22%，赤小豆为23.17%～25.57%。由此对比，紫云英种子蛋白质含量与大豆相当，十分丰富。紫云英种子的脂肪含量（表2）与鹰嘴豆（6.48%）和赤小豆（1.92%～3.42%）相似，低于大豆（14.13%～22.19%）脂肪含量，淀粉含量也低于绿豆淀粉含量（约50%）。综上所述，紫云英种子具有高蛋白、低淀粉、低脂肪的特点，且皖紫1 号种子蛋白质含量可与大豆媲美，是一种良好的蛋白质补充剂。

由表2 可知，皖紫1 号种子蛋白质明显高于湘紫1 号，粗脂肪含量为湘紫1 号的1.3 倍，灰分含量更低，淀粉、粗纤维、水分与湘紫1 号无明显差异。这说明从基本营养成分角度考虑，皖紫1 号种子营养价值高于湘紫1 号。

表2 紫云英种子基本成分Table 2 Basic components of Xiang seeds and Wan seeds

2.2 紫云英苗菜生长过程

图1 为紫云英苗菜第1～14 d 的生长情况。第3 d（图1C）形成胚根，第4 d（图1D）长出两片子叶，下胚轴和胚根伸长，叶片长大。第5～10 d（图1E～图1J），胚根由0.75 cm 生长到3.45 cm，子叶叶片更大更密，第5 d 长出真叶，之后下胚轴长度基本不变，上胚轴长度变长，真叶叶片变大，10 d 后外观形态趋于稳定，茎高在6 cm 左右。

图1 湘紫1 号苗菜生长过程Fig.1 Vegetation process of Xiang sprouts

2.3 紫云英苗菜总酚、总黄酮含量的变化

如图2 和图3 所示，湘紫1 号、皖紫1 号苗菜萌发过程中总酚、总黄酮含量呈上升趋势，均在第14 d 时达到最大。这与小麦、绿豆萌发后次级产物积累趋势类似。这是因为豆类种子萌发过程中，莽草酸途径、苯丙烷代谢途径和类黄酮代谢途径关键酶、限速酶如苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羟化酶（C4H）、4-香豆酰辅酶A 连接酶（4CL）、査耳酮合成酶（CHS）等酶活上升，促进糖酵解的中间产物磷酸烯醇式丙酮酸（EMP）和赤藓糖-4-磷酸（PPP）合成植物多酚、黄酮等次级代谢产物。

图2 苗菜总酚含量Fig.2 Total phenolic content in CMV sprouts

图3 苗菜总黄酮含量Fig.3 Total flavonoids content in CMV sprouts

皖紫1 号苗菜总酚、总黄酮含量普遍高于湘紫1 号，发芽14 d 的皖紫1 号总酚、总黄酮在水培苗菜中最高。萌发8～14 d 中，皖紫1 号苗菜总酚含量由6.45 mg/g 上升至7.31 mg/g，增长13.33%，总黄酮含量由5.12 mg/g 上升至5.86 mg/g，含量上升14.45%，分别达到生长3 个月土培成熟茎叶总酚含量（12.96±0.23 mg/g）、总黄酮含量（10.55±0.13 mg/g）的50%和45%，可见在总酚、总黄酮方面，发芽14 d 的皖紫1 号单位时间投入产出比更高。

2.4 紫云英酚类成分分析

如表3，在紫云英苗菜、土培成熟茎叶中共检测出14 种酚类化合物，其中7 种酚酸，5 种黄酮类化合物，2 种多酚化合物。在紫云英苗菜、土培成熟茎叶中均未检测出原儿茶酸、对羟基苯甲酸、表儿茶素和肉桂酸。

表3 湘紫1 号酚类物质含量Table 3 Basic components of Xiang seeds and Wan seeds

在湘紫1 号苗菜和皖紫1 号苗菜发芽8～14 d的过程中，酚类化合物总量随发芽时间升高，与总酚、总黄酮含量变化趋势一致。皖紫1 号苗菜酚类化合物含量显著高于湘紫1 号苗菜，发芽8、10、14 d 时皖紫1 号苗菜酚类物质总量是湘紫1 号苗菜的1.28、1.21、1.42 倍，在发芽14 d 时达到41.28±1.85 mg/kg。

酚类物质具有抗氧化、抗肿瘤、调节成骨细胞分化、神经免疫调节和神经保护作用等多种药理学活性。发芽14 d 的皖紫1 号苗菜酚类化合物种类丰富，其中共检测出12 种酚类化合物，比土培成熟茎叶多检测出没食子酸、阿魏酸、香草酸、水杨酸、丁香酸5 种酚类物质。发芽14 d 的皖紫1 号苗菜优势成分为山奈酚、芹菜素、槲皮素、对香豆酸、没食子酸、木犀草素和阿魏酸，其中，山奈酚、对香豆酸、没食子酸含量分别为发芽14 d 湘紫1 号苗菜的1.67、1.69 和13 倍，山奈酚含量（12.86±0.34 mg/kg）是豌豆尖山奈酚含量的2～15 倍，槲皮素含量与豌豆尖相当，对香豆酸含量为4.59±0.13 mg/kg，约为土培成熟茎叶的33 倍。

发芽14 d 的皖紫1 号苗菜酚类含量丰富，酚类物质的单位时间投入产出比优于湘紫1 号和土培成熟茎叶，有进一步开发利用潜力。短时开发酚类物质丰富的紫云英菜品，可选择皖紫1 号水培14 d。

2.5 紫云英苗菜抗氧化评价

2.5.1 DPPH 自由基清除能力评价 如图4A 所示，紫云英苗菜在8～14 d 对DPPH 自由基的IC与发芽天数呈负相关，发芽14 d 湘紫1 号苗菜IC为15.18 mg/mL，是其发芽8 d IC（21.77 mg/mL）的70%；发芽14 d 皖紫1 号苗菜IC为9.53 mg/mL，是其发芽8 d IC（19.44 mg/mL）的49%。可见，随发芽天数的增加，湘紫1 号和皖紫1 号苗菜对DPPH自由基的IC显著下降，清除能力逐渐增强。同时，皖紫1 号苗菜IC值明显低于湘紫，发芽14 d 皖紫1 号苗菜IC是同期湘紫的63%，是生长三个月土培成熟茎叶（4.76 mg/mL）的2.00 倍，可以得出，皖紫1 号苗菜对DPPH 自由基的清除能力优于湘紫1 号苗菜，发芽14 d 皖紫1 号苗菜DPPH 自由基清除能力在水培苗菜中最强，但弱于土培成熟茎叶。

如图4B 和图4C 所示，苗菜对DPPH 自由基的清除能力在0.5～15 mg/mL 的范围内呈浓度依赖性。随浓度的增加，发芽14 d 的皖紫1 号苗菜对DPPH 自由基的清除能力由13.97 mmol TE/L 升至22.64 mmol TE/L，成熟茎叶对DPPH 自由基清除能力由16.92 mmol TE/L 升至37.29 mmol TE/L。因此，在0.5～15 mg/mL 范围内，可以通过提高水培苗菜提取液浓度，提高DPPH 清除能力，从而通过14 d水培得到DPPH 自由基清除能力较强的产品。

图4 紫云英苗菜DPPH+自由基清除能力Fig.4 DPPH+ scavenging activity of CMV sprouts

2.5.2 苗菜ABTS自由基清除能力评价 如图5A所示，发芽8～14 d 的湘紫和皖紫苗菜对ABTS自由基的IC与发芽天数呈负相关，随发芽天数的增加，湘紫苗菜对ABTS自由基的IC值由8.18 mg/mL下降至6.08 mg/mL，皖紫对ABTS自由基的IC值由7.19 mg/mL 显著下降至4.08 mg/mL，湘紫和皖紫苗菜在发芽第8～14 d 内对ABTS自由基的清除能力随发芽天数的增加而增强。发芽8～14 d，湘紫苗菜发芽对ABTS自由基的IC值均明显高于相同天数的皖紫苗菜，即皖紫苗菜对ABTS自由基的清除能力优于湘紫苗菜。

如图5B 和图5C 所示，发芽14 d 的湘紫苗菜清除能力由2.43 mmol TE/L 上升至20.96 mmol TE/L，发芽14 d 的皖紫苗菜清除能力由2.20 mmol TE/L 上升至20.8 mmol TE/L，而土培成熟茎叶由4.57 mmol TE/L 上升至21.19 mmol TE/L，即苗菜对ABTS自由基的清除能力在0.5～15 mg/mL 的范围内与浓度成正相关，随浓度的增加，苗菜对ABTS自由基的清除能力逐渐上升。

图5 紫云英苗菜ABTS+自由基清除能力Fig.5 ABTS+ scavenging activity of CMV sprouts

与土培成熟茎叶相比，两类苗菜对ABTS自由基的清除能力较弱，但当浓度到达15 mg/mL 时，发芽14 d 的湘紫苗菜和皖紫苗菜对ABTS自由基的清除能力与土培成熟茎叶相当，这说明发芽14 d 后，紫云英苗菜具有可观的抗氧化性，而且水培的紫云英苗菜耗时短，成本低，与土培相比更有潜力获得经济回报。

2.5.3 苗菜酚类物质含量与抗氧化性的相关性分析

如表4，湘紫1 号苗菜和皖紫1 号苗菜的总酚、总黄酮含量与DPPH、ABTS自由基清除能力显著相关，研究人员在水稻、绿豆芽苗菜、桃子中也观察到了这一现象。山奈酚、槲皮素、阿魏酸在两种紫云英苗菜中与DPPH、ABTS自由基清除能力显著相关，表示这三种酚类化合物对2 种紫云英水培苗菜抗氧化能力的贡献率较大。皖紫1 号苗菜中木犀草素、对香豆酸、没食子酸与DPPH 和ABTS自由基清除能力显著相关，而这三种酚类化合物在湘紫1 号中没有表现出较高相关性，从而解释了皖紫1 号苗菜抗氧化性强于湘紫1 号的原因。

表4 苗菜酚类含量与抗氧化性之间的相关性Table 4 Correlation of phenolics and antioxidant activities

植物体展示出抗氧化性是一个复杂体系相互作用的结果。伴随种子萌发，植物体中有非酶与酶促两个抗氧化系统共同维持着细胞内的氧化还原平衡。非酶方面，游离氨基酸、抗坏血酸、酚类化合物都具有直接清除自由基的作用，皖紫1 号种子蛋白含量比湘紫1 号种子更丰富，萌发过程中皖紫1 号中更丰富的蛋白质可能会分解产生更丰富的游离氨基酸，从而表现出更强的抗氧化作用；酶促抗氧化系统方面，随着萌发过程中细胞内活性氧水平的上升，过氧化氢、丙二醛（MDA）等氧化代谢产物逐渐积累，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）的酶活和相关基因表达量也可能影响苗菜的抗氧化性。本文从酚类化合物角度揭示了皖紫1 号苗菜抗氧化性较强的原因，为紫云英苗菜选种、育苗提供了初步理论支撑，下一步可以从游离氨基酸和酶促角度进一步深挖紫云英水培苗菜发芽过程中抗氧化动态机制，得到营养物质含量更丰富、功能性更强的产品。

3 结论

本文探究了湘紫1 号、皖紫1 号两种紫云英种子水培开发过程中酚类物质和抗氧化性的动变化，从酚类化合物角度揭示了皖紫1 号苗菜抗氧化性较强的原因。结果表明，两类紫云英苗菜生长过程中总酚、总黄酮含量以及抗氧化能力均呈上升趋势，15 mg/mL 浓度下，发芽14 d 两类苗菜对ABTS自由基的清除能力可媲美土培成熟茎叶；水培14 d 的皖紫1 号苗菜酚类含量丰富，总酚、总黄酮含量达到7.31 和5.86 mg/g，共检测出12 种酚酸化合物，比土培成熟茎叶多检测出5 种酚类物质，对香豆酸含量达到土培成熟茎叶的33 倍；皖紫苗菜培育周期短，成本较低，酚类物质和抗氧化能力较强，单位时间投入产出比更高，因此更有潜力获得经济回报。下一步可以从游离氨基酸和酶促角度进一步深挖紫云英水培苗菜发芽过程中抗氧化动态机制，为紫云英水培苗菜的开发提供更为全面的科学依据。