接种丛枝菌根真菌和氮沉降处理对灌木铁线莲根际微生态环境的影响1)

刘婷岩 张之月 郝龙飞 岳永杰 何炎红 于凡舒 小红

(内蒙古农业大学，呼和浩特，010019)

氮素是植物生长发育的大量营养元素之一，在植物生长过程中起着重要作用。随着人类大量使用化石燃料以及农业上施用氮肥等，导致大气氮沉降不断增加，造成了一系列环境问题，包括土壤酸化板结、生物多样性降低、植物生产力和结构功能改变等[1]。有研究预测，到2050年人为活性氮年排放量将达到2.0×108t[2]。森林生态系统作为全球生态系统的重要组成部分，氮沉降对森林生态系统的影响大于其它陆地生态系统[3]。大量氮沉降会造成植物体内养分元素比例失衡，改变森林下层的物种组成，进而影响土壤微生物群落结构及生物功能发挥[4]。樊后保等[5]研究表明，氮沉降引起土壤有效氮含量明显上升，而其它养分含量(有机质、速效磷、速效钾)均呈下降趋势。

丛枝菌根真菌(AMF)是土壤微生物区系中分布最广泛的一类菌根真菌，能与80%以上的陆生植物根系形成菌根共生体。在菌根共生体中，植物将一部分糖类和脂类有机物分配给丛枝菌根真菌供其生长，丛枝菌根真菌根外菌丝网络帮助植物吸收土壤中的矿质养分，特别是土壤中移动性较差，且植物根系吸收相对困难的养分，如磷(P)、铜(Cu)、锌(Zn)等[6]。也有研究表明，丛枝菌根真菌在增强宿主植物抗逆性方面具有重要作用[7-8]。同时丛枝菌根真菌根外菌丝可以吸收不同形态的氮，包括硝态氮、铵态氮等[9-10]。丛枝菌根真菌地下菌丝网络还可以调节固氮植物和非固氮植物、草本植物和木本植物间铵态氮和硝态氮的平衡[8]。球囊霉素相关土壤蛋白，是土壤有机质的重要组分。1996年，Wright et al.[11]认为，球囊霉素是由丛枝菌根真菌分泌产生的一类糖蛋白；但由于目前土壤中提取球囊霉素的方法尚不能得到高纯度的球囊霉素，一些研究者对球囊霉素的来源仍持有质疑[12]。有的研究[13]认为，接种丛枝菌根真菌可以显著提高土壤球囊霉素含量；有的研究[14]认为，丛枝菌根真菌与球囊霉素间的关系表现为无相关或负相关。有的研究[15-16]认为，氮添加对土壤球囊霉素含量变化并无显著影响；有的研究[17]认为，氮沉降影响丛枝菌根真菌与植物的共生关系。以往研究中，主要开展了接种丛枝菌根真菌和氮沉降单一因素对根际微生态环境的影响，而对二者交互作用影响的研究相对较少。

灌木铁线莲(Clematisfruticosa)具有较强的适应性和抗逆性[18]，对干旱地区生态保护具有重要作用，是干旱、半干旱地区荒山绿化的优良树种[19]。为此，本研究以单接种根内根孢囊霉(Rhizophagusintraradices)、单接种摩西斗管囊霉(Funneliformismosseae)、按照1∶1混合接种根内根孢囊霉与摩西斗管囊霉的盆栽灌木铁线莲菌根苗和非菌根苗(不接菌处理)为研究对象，设置对照(不施氮)、低氮、中氮、高氮4个氮添加处理，在接菌处理的苗木菌根侵染率达到60%以上后进行氮沉降控制试验。测定接菌和氮沉降处理的灌木铁线莲苗木菌根侵染率、根际土壤养分特征及球囊霉素相关土壤蛋白等指标，采用最小显著差异法分析接菌和氮沉降处理对上述指标的影响；采用偏最小二乘路径模型分析不同处理对土壤速效养分的影响。旨在为改善灌木铁线莲苗木根际土壤微生态环境提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

灌木铁线莲种子采集于内蒙古呼和浩特市新城区水磨村(地理中心坐标：北纬40.96°，东经111.84°)。将种子用质量分数为2%的KMnO4溶液消毒30 min，并用去离子水冲洗净；然后用于播种。试验所用丛枝菌根真菌(AMF)为根内根孢囊霉、摩西斗管囊霉，由黑龙江大学生态修复实验室赠予。使用的扩繁菌剂的宿主植物为紫花苜蓿(Medicago sativa)，扩繁基质为沙土混合物(V(沙)∶V(土)为3∶1)，最终的接种剂为扩繁基质、侵染根段、孢子、菌丝的混合物。

1.2 试验设计

试验设置4个接菌处理，分别为：不接菌处理、单接种根内根孢囊霉处理、单接种摩西斗管囊霉处理、按照1∶1混合接种根内根孢囊霉与摩西斗管囊霉处理。

2019年10月份，在育苗盆(上口内径15 cm、底部内径9 cm、盆内高13 cm)底部放入高温高压灭菌基质(V(土)∶V(蛭石)=2∶1)至盆内高度4/5处，然后在灭菌基质上平铺混匀且长势良好的30.0 g菌剂；不接菌处理中，加入等量固体灭菌基质；将灌木铁线莲种子播入其中，其上再覆盖灭菌基质，每盆质量控制1.0 kg。浇透水后，置于内蒙古农业大学森林培育人工气候室(温度20～25 ℃，湿度40%～60%，最大光照强度10 000 lx)培养，每盆保留3株幼苗。

2020年4月份，测定接菌处理的苗木菌根侵染率达到了60%以上(未接菌处理苗木菌根侵染率为0)，开展氮沉降控制试验。参考全球氮沉降水平和国内外氮添加试验[20]，并根据试验区氮沉降背景值为3.43 g·m-2·a-1[21]，设置4个氮添加量：对照(不施氮)、低氮(3 g·m-2·a-1)、中氮(6 g·m-2·a-1)、高氮(9 g·m-2·a-1)。

表1 模拟氮沉降处理

1.3 指标测定方法

丛枝菌根真菌侵染率、孢子密度、球囊霉素相关土壤蛋白测定：侵染率，用体积分数为5%(醋酸墨水(派克墨水)染色20 min，然后采用网格十字交叉法测定[22]；孢子密度，采用湿筛倾析-蔗糖离心法测定[23]；易提取球囊霉素相关土壤蛋白(EE-GRSP)、总球囊霉素相关土壤蛋白(T-GRSP)的提取和定量分析，借鉴文献[11]和[24]的方法。

土壤理化性质的测定：土壤有机质采用重铬酸钾容量法测定，用过量的重铬酸钾-硫酸(K2Cr2O7-H2SO4)溶液氧化土壤有机质中的碳，根据消耗的重铬酸钾计算出有机碳量，乘以常数1.724，得出土壤有机质的量；土壤碱解氮，采用碱解扩散法测定；土壤有效磷，采用浸提-钼锑抗比色法测定；土壤速效钾，用火焰光度法测定；土壤pH使用盐浸pH计测定[25]。

1.4 数据处理

利用Microsoft Excel 2019进行数据整理，采用IBM SPSS Statistics 20.0软件进行统计分析；采用最小显著差异法分析接菌和氮沉降处理对丛枝菌根真菌侵染率、孢子密度、易提取球囊霉素质量分数、总球囊霉素质量分数、土壤理化性质的影响；采用偏最小二乘路径模型分析不同处理对土壤速效养分的影响。

2 结果与分析

2.1 接菌和氮沉降处理对灌木铁线莲菌根侵染率和孢子密度的影响

由表2可见：不接菌处理时，灌木铁线莲苗木菌根侵染率和根际土壤孢子密度为0。3种接菌处理时，菌根侵染率和孢子密度，均随氮添加量增加呈先增加后减少的趋势，且均在低氮处理时达到最大。单接种根内根孢囊霉处理、按照1∶1混合接种根内根孢囊霉与摩西斗管囊霉处理时，低氮处理苗木菌根侵染率均显著高于其它氮沉降处理；而单接种摩西斗管囊霉处理时，氮沉降处理间无显著差异。不施氮处理、低氮处理时，按照1∶1混合接种根内根孢囊霉与摩西斗管囊霉处理的苗木，菌根侵染率达到最大；而中氮处理、高氮处理时，单接种摩西斗管囊霉处理的菌根侵染率达到最大，且比单接种根内根孢囊霉处理增加了9.48%(P<0.05)、5.67%(P<0.05)，比按照1∶1混合接种根内根孢囊霉与摩西斗管囊霉处理增加了4.92%(P>0.05)、7.05%(P<0.05)。3种接菌处理时，低氮处理中灌木铁线莲根际土壤孢子密度均显著高于其它氮沉降处理。各氮沉降处理中，根际土壤孢子密度均在单接种摩西斗管囊霉处理达到最大，且显著高于单接种根内根孢囊霉处理、按照1∶1混合接种根内根孢囊霉与摩西斗管囊霉处理。

表2 不同接菌和氮沉降处理时灌木铁线莲苗木丛枝菌根真菌侵染率和根际土壤孢子密度

本研究表明，各接菌处理的丛枝菌根真菌侵染率和孢子密度，在低氮处理或中氮处理时达到最大，而在高氮处理时最小，说明一定范围内的氮添加有助于提高丛枝菌根真菌的侵染率。原因为氮添加使土壤中供植物直接吸收的有效氮增加，促进了植物生长，相应也增加了植物对菌根真菌的碳供应，加强了菌根共生关系，进而促进植物借助菌丝网络吸收的有效氮[26]。在高氮处理时，单接种摩西斗管囊霉处理的苗木菌根侵染率无显著变化，而单接种根内根孢囊霉处理、按照1∶1混合接种根内根孢囊霉与摩西斗管囊霉处理的苗木菌根侵染率显著降低，且高氮处理导致丛枝菌根真菌孢子密度降低；原因是高氮环境下的土壤中存在大量的硝酸根离子，造成土壤pH的变化，从而刺激或者抑制丛枝菌根真菌的产孢性能[27]。不施氮处理、低氮处理的苗木，菌根侵染率最大值出现在按照1∶1混合接种根内根孢囊霉与摩西斗管囊霉处理；是因为在低氮处理时人工氮输入尚未成为制约菌根侵染率的主要因素。在中氮处理和高氮处理时，苗木菌根侵染率在单接种摩西斗管囊霉处理时达到最大，显著高于单接种根内根孢囊霉处理和按照1∶1混合接种根内根孢囊霉与摩西斗管囊霉处理。由此认为，与植物共生的摩西斗管囊霉比根内根孢囊霉更能耐受高氮环境。已有研究认为，丛枝菌根真菌通过调控植物抗性基因表达、调节真菌本身和宿主的激素平衡、提高植物体内抗氧化酶的活性和表达量等方式，抵抗高盐碱胁迫[28]。有研究表明，丛枝菌根真菌个体和群落功能之间存在较大差异：杨如意等[29]研究表明，根内球囊霉和幼套球囊霉，比摩西球囊霉更能有效减缓铜胁迫对玉米(Zeamays)生长和部分生理特性的抑制作用；Gonzalez-Chavez et al.[30]研究表明，丛枝菌根真菌BEG-133对Cu吸收能力，显著低于BEG-132和BEG-134，这种差别与其根外菌丝的阳离子交换量直接相关。

2.2 接菌和氮沉降处理对灌木铁线莲根际土壤球囊霉素质量分数的影响

由表3可见：接菌和氮沉降处理，对灌木铁线莲根际土壤易提取球囊霉素、总球囊霉素的影响存在差异。与不施氮处理相比，低氮处理显著降低了不接菌处理、按照1∶1混合接种根内根孢囊霉与摩西斗管囊霉处理的苗木根际土壤易提取球囊霉素质量分数，中氮处理仅显著降低了不接菌处理的易提取球囊霉素质量分数，高氮处理仅显著增加了单接种根内根孢囊霉处理的易提取球囊霉素质量分数。不同氮沉降处理，对单接种摩西斗管囊霉处理的苗木根际土壤易提取球囊霉素质量分数均无显著影响。氮沉降处理，显著影响不接菌处理、单接种摩西斗管囊霉处理的苗木根际土壤总球囊霉素质量分数，而对单接种根内根孢囊霉处理、按照1∶1混合接种根内根孢囊霉与摩西斗管囊霉处理无显著影响。不施氮处理时，单接种根内根孢囊霉处理、单接种摩西斗管囊霉处理的苗木，根际土壤易提取球囊霉素质量分数比不接种处理分别显著降低了22.95%、14.75%；而高氮处理时，仅单接种摩西斗管囊霉处理的苗木，根际土壤易提取球囊霉素质量分数比不接菌处理显著降低了31.25%。不施氮处理时，不同接菌处理对苗木根际土壤总球囊霉素质量分数均无显著影响；而高氮处理时，单接种根内根孢囊霉处理、单接种摩西斗管囊霉处理的苗木根际土壤总球囊霉素质量分数，显著低于不接菌处理、按照1∶1混合接种根内根孢囊霉与摩西斗管囊霉处理。

表3 不同接菌和氮沉降处理时灌木铁线莲根际土壤球囊霉素质量分数

球囊霉素相关土壤蛋白的来源，目前业内没有形成共识[12]。已有研究[12]表明，在丛枝菌根真菌生物量低的土壤中，球囊霉素相关土壤蛋白的质量分数也比较低，因此认为球囊霉素相关土壤蛋白主要是由丛枝菌根真菌的菌丝分泌。但Holátko et al.[14]研究认为，土壤中球囊霉素相关土壤蛋白质量分数与丛枝菌根真菌丰度之间的关系，并不总是正相关，甚至表现为负相关。本研究表明，在未接菌处理时的根际土壤中，仍可以检测到球囊霉素相关土壤蛋白。原因为土壤中原有的球囊霉素相关土壤蛋白存在，在高温高压灭菌后土壤微生物被灭活，进而影响了球囊霉素相关土壤蛋白的循环过程，导致土壤中保留量相对增加；也是因为球囊霉素不仅来源于丛枝菌根真菌，与生活在丛枝菌根真菌菌丝表面生物膜中的生物或其代谢产物有关[14]。本研究结果表明，不施氮处理时，混合接菌处理的苗木根际土壤球囊霉素相关土壤蛋白质量分数与不接菌处理无显著变化，其中易提取球囊霉素相关土壤蛋白与较单一接菌处理有显著增加，而总球囊霉素相关土壤蛋白无明显变化。说明混合接菌处理并未发挥丛枝菌根真菌之间的协同作用，根内根孢囊霉与摩西斗管囊霉存在竞争关系。易提取和总球囊霉素相关土壤蛋白之间存在变化的差异，是因为易提取球囊霉素相关土壤蛋白是土壤中新近产生的与土壤结合不紧密的球囊霉素相关土壤蛋白，而总提取球囊霉素相关土壤蛋白质量分数则较稳定[31]。易提取球囊霉素相关土壤蛋白在单接种摩西斗管囊霉处理时，随着氮沉降递增无显著变化，也进一步证明了摩西斗管囊霉更耐氮。

2.3 接菌和氮沉降处理对灌木铁线莲根际土壤理化性质的影响

由表4可见：不同接菌处理时，苗木根际土壤碱解氮质量分数，均在高氮处理时达到峰值，且均显著高于不施氮处理。单接种摩西斗管囊霉处理时，高氮处理的苗木根际土壤碱解氮质量分数比不施氮处理的增加量最小，而不接菌处理的苗木根际土壤碱解氮质量分数的增加量最大。不施氮处理时，单接种根内根孢囊霉处理、单接种摩西斗管囊霉处理的苗木，根际土壤有机质质量分数、碱解氮质量分数、有效磷质量分数、速效钾质量分数、pH，均低于不接菌处理；高氮处理时，单接种摩西斗管囊霉处理的苗木，根际土壤有机质质量分数、碱解氮质量分数、有效磷质量分数、速效钾质量分数、pH均最低。不同接菌处理时，随氮沉降增加有机质质量分数呈先增加后减少的趋势。其中，单接种根内根孢囊霉处理、单接种摩西斗管囊霉处理时，中氮处理的苗木根际土壤有机质质量分数，分别比不施氮处理显著增加了38.35%、81.62%；不接菌处理、按照1∶1混合接种根内根孢囊霉与摩西斗管囊霉处理时，氮沉降处理间苗木根际土壤有机质质量分数均无显著影响。不同氮沉降处理时，各接菌处理间苗木根际土壤碱解氮质量分数，由大到小依次为不接菌处理、按照1∶1混合接种根内根孢囊霉与摩西斗管囊霉、单接种根内根孢囊霉处理、单接种摩西斗管囊霉处理。高氮处理时，单接种根内根孢囊霉、单接种摩西斗管囊霉、按照1∶1混合接种根内根孢囊霉与摩西斗管囊霉处理的苗木根际土壤有效磷质量分数，分别比不接菌处理的显著降低了50.40%、68.29%、64.10%；单接种根内根孢囊霉、单接种摩西斗管囊霉、按照1∶1混合接种根内根孢囊霉与摩西斗管囊霉处理的苗木，根际土壤速效钾质量分数，分别比不接菌处理的显著降低了36.85%、42.00%、36.35%。高氮处理时，单接种根内根孢囊霉处理的苗木根际土壤pH，比不施氮处理增加了0.50%(P<0.05)；而单接种摩西斗管囊霉处理比不施氮处理苗木根际土壤pH降低了0.87%(P<0.05)。

表4 不同接菌和氮沉降处理时灌木铁线莲根际土壤理化性质

不同接菌处理时，有机质随氮沉降增加均呈先增加后减少的趋势。混合接菌处理时，氮沉降处理间的有机质质量分数差异不显著；原因是根内根孢囊霉与摩西斗管囊霉之间，由于生态位接近而存在竞争关系[32]。易提取和总球囊霉素相关土壤蛋白质量分数，均与有机质质量分数呈正相关，证明土壤中有机质和有效养分的增加，有利于球囊霉素相关土壤蛋白的合成[33-34]。随氮沉降增加，土壤碱解氮呈现增加趋势。因为人为氮添加，植物根际周围的氮增多，不接菌处理的苗木根际土壤在高氮处理时，碱解氮质量分数最高，说明灌木铁线莲氮吸收量已经饱和，原有的生态平衡被打破。接菌处理显著降低了高氮环境的碱解氮质量分数，表明接菌处理促进苗木对外界环境的适应能力[35]，提高植物对高氮沉降的耐受能力。原因是接菌处理增加了植物养分吸收[36]，土壤中外界的氮输入被稀释，缓解外界氮添加对植物的影响，避免高氮环境的“烧苗”现象。与不接菌处理相比，接种摩西斗管囊霉后，根际土壤有效磷质量分数、速效钾质量分数在高氮沉降处理时最低，可见摩西斗管囊霉在高氮处理时仍有效促进了植物养分吸收，与根内根孢囊霉与植物的共生关系相比，接种摩西斗管囊霉植物对氮的耐受性更强一些。

2.4 接菌和氮沉降处理对灌木铁线莲根际土壤速效养分影响的主要途径

由图1可见：通过偏最小二乘路径模型分析，氮沉降处理、接菌处理、球囊霉素相关土壤蛋白、pH、菌根侵染率、孢子密度，对速效养分(碱解氮、有效磷、速效钾)影响的拟合度为0.63。氮沉降处理对速效养分的影响为正效应(0.38)，氮沉降处理对pH的影响为负效应(-0.46)。pH对球囊霉素相关土壤蛋白的影响为正效应(0.52)、氮沉降处理对球囊霉素相关土壤蛋白的影响为正效应(0.34)，进而作用于球囊霉素相关土壤蛋白对速效养分的影响为正效应(0.27)。接菌处理对菌根侵染率的影响为正效应(0.77)，进而作用于菌根侵染率对速效养分的影响为负效应(-0.72)。影响速效养分的因子总效应分析表明，各项因子的效应系数，由大到小依次为接菌处理(0.55)、pH(0.38)、氮沉降(0.36)、菌根侵染率(0.31)、球囊霉素相关土壤蛋白(0.27)和孢子密度(0.06)。

本研究通过偏最小二乘路径模型分析表明，接菌处理通过影响菌根侵染率，进而影响土壤速效养分质量分数，原因是菌根侵染率越高，植物长势越好，导致土壤养分消耗量越大；菌根侵染率与土壤孢子密度有显著的正相关关系[37]。本研究结果表明，孢子密度对速效养分没有直接影响，而是与土壤中丛枝菌根真菌繁殖有关，孢子萌发侵染植物根系后，通过影响植物和菌根真菌的共生关系，间接影响土壤速效养分。本研究认为，接菌和氮沉降处理对苗木根际微生态环境的影响总体表现为正效应，然而一定程度上菌根真菌对微生态环境的调控作用被高氮输入削弱，且对耐氮性弱的菌根真菌调控作用抑制作用明显。

3 结论

综合分析研究结果，适当地氮添加(3 g·m-2·a-1)可以增加接种丛枝菌根真菌的灌木铁线莲苗木菌根侵染率和根际土壤孢子密度，促进根际土壤球囊霉素相关土壤蛋白的合成。摩西斗管囊霉比根内根孢囊霉更能忍受高氮环境，有助于加快土壤速效养分循环，更有效调控灌木铁线莲苗木根际土壤微生态环境。