一株野生花脸香蘑的鉴定及其液体培养基的筛选*

崔 晓，丛倩倩，王庆武，兰玉菲，陈万杰

（1．泰安市农业科学院食用菌研究所，山东 泰安 271000；2．冠县农业农村局，山东 冠县 252500）

花脸香蘑（Lepista sordida） 又称紫晶蘑、紫花脸等[1]，属于担子菌门（Basidiomycota） 伞菌纲（Agaricomycetes） 伞菌目 （Agaricales） 口蘑科 （Tricholomataceae） 香蘑属（Lepista）[2]，主要分布于我国东北地区及河北、山东、四川、云南、贵州等地。子实体颜色鲜艳，气味浓香，味道鲜美。花脸香蘑营养价值较高，其子实体干品中含粗蛋白43．03%、多糖10．31%、粗纤维 7．6%、脂肪 2．01%，氨基酸种类齐全，符合FAO/WHO优质蛋白质的要求，还含有钙、铁、锌等人体必需的微量元素及维生素[3-5]。不仅是餐桌佳品，还兼具防癌、抗肿瘤[6]等功效，是一种珍稀优良的食用菌，极具市场开发潜力[7-9]。

菌种是食用菌产业的最基本要素，液体菌种在生产上有生长快、活力强、接种方便等优点[10-11]，有助于缩短制种周期、提高菌类的产量和品质。近年来常作为配套技术应用于金针菇（Flammulina velutipes）、香菇（Lentinula edodes） 等菌类的工厂化生产中。相对于平菇（Pleurotus ostreatus）、黑木耳（Auricularia auricula）等大宗菌类，香蘑属菌株的菌丝生长较慢、长势弱，液体菌种在提高其制种水平上将有很大应用潜力。

通过对分离自泰山山脉的1株野生菌株进行分类鉴定，并初步筛选出适合其生长的液体培养基，旨在为下一步驯化选育和综合开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1．1．1 供试菌株

供试子实体于2016年采集于山东省泰山山脉（36°16′13″N，117°04′07″E，海拔 581 m），通过组织分离获得纯化菌株，编号为ts916，保存于泰安市农业科学院食用菌研究所。

1．1．2 培养基

PDA培养基：去皮马铃薯200 g、葡萄糖20 g、KH2PO43 g、MgSO41．5 g、琼脂 20 g，加水定容至1 L。121℃灭菌30 min，每平板定量为20 mL。

1.2 菌株鉴定

1．2．1 菌株纯化

采用组织分离法得到野生子实体的PDA纯培养物。经过3次纯化（25℃恒温避光培养，单次培养时间为10 d～15 d） 培养获得菌丝纯培养物，编号为ts916。菌丝纯培养物保藏于4℃冰箱备用。

1．2．2 形态学鉴定

形态学鉴定采用宏观形态特征与显微结构相结合的方法。参照《中国大型真菌》[2]对ts916菌株子实体进行形态学鉴定，对照观察子实体及附属物等外观特征，以及是否有特殊气味；挑取试管中保藏的菌块于PDA平板培养基上活化，每天观察菌落特征直至菌落长满平板；用插片法显微观察菌丝、孢子等特征。

1．2．3 分子生物学鉴定

1） ITS序列扩增与测序

采用真菌总DNA提取试剂盒提取菌丝DNA，后使用真菌ITS通用引物进行PCR扩增。引物序列为 ITS1 （5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）、ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。

PCR 反应体系 50 μL：模板 1 μL （约 20 ng），2 × PCR Taq Master Mix 25 μL，0．4 nmol·L-1正向引物和反向引物各1 μL，ddH2O补足至50 μL。

PCR扩增反应程序为94℃预变性5 min；94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，共35个循环；最后72℃补平7 min；4℃终止反应。

PCR扩增产物的DNA纯化、测序由山东省农业科学院生物技术研究中心完成。

2）系统发育树的构建

将测得的ITS序列用DNAMAN进行拼接，将拼接后的ITS序列提交至GenBank数据库，BLAST检索获得多条同源性较高的rDNA ITS参考序列，使用MEGA 7．0进行系统发育树的构建。

1.3 菌株液体培养基筛选

根据参考文献[10]的配方进行调整，5种液体培养基的配方见表1。

表1 液体培养基配方Tab．1 The formulas of liquid culture media

如表1所示，配方中去皮马铃薯、玉米粉、麦麸用沸水煮30 min，4层纱布过滤。依次加入其他材料，加水定容至1 L。分装至250 mL三角瓶中，每瓶装液量为150 mL，每种液体培养基重复5次。灭菌冷却至室温后，每个三角瓶中接种大小约为0．5 cm3的菌块5块。接种后置于恒温摇床140 r·min-1，25℃培养7 d。观察记录菌液颜色、气味和密度。培养完成后55℃烘箱烘干菌丝至质量恒定，以每100毫升液体培养基中所含的菌丝体干质量（g）为指标计算其生物量。

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定

供试ts916菌株的子实体形态特征见图1。

图1 野生菌株ts916子实体Fig．1 Fruit body of wild strain ts916

如图1所示，野生菌株ts916子实体群生或近丛生，子实体中等；菌盖直径为3 cm～8 cm，幼时呈半球形，后平展，边缘内卷，新鲜时为白色或淡紫色；菌肉为淡紫色，较薄，呈水浸状；菌褶直生，不等长；菌柄长度为 4．0 cm～6．5 cm，直径为 0．3 cm～1．2 cm，紫色，实心，基部多弯曲。春季和秋季多见于山坡草地、菜园、火烧地等处，可形成蘑菇圈。有独特蘑菇香味。

菌种ts916经活化后转接到PDA培养基上，菌丝呈白色，绒毛状，后期逐渐变为紫色，菌丝浓密，气生菌丝茂盛。培养后期会产生色素，培养基变为紫色。约12 d～16 d菌丝可长满整个平皿。

菌丝及孢子的显微结构特征见图2。

图2 野生菌株ts916显微结构Fig．2 Microstructure of wild strain ts916

由图2可知，光学显微镜下观察ts916菌株的菌丝体形态显示，其菌丝无色透明，具有锁状联合。孢子无色，呈椭圆形至卵圆形。

2.2 分子鉴定

对菌株ts916的rDNA ITS序列进行PCR扩增和测序，获得长度为660 bp的DNA片段，将获得的ITS序列上传至NCBI获得序列号MG516585，并进行BLAST比对。从NCBI数据库内下载已知的多条相似序列作为参考序列，以卵孢奥德蘑Oudemansiella raphanipes（MT974249） 为外群，并运行1 000次以Bootstrap检验系统发育树的可靠性，运用MEGA 7．0软件Neighbor-Joining法构建系统发育进化树，详见图3。

图3 基于rDNA ITS构建的NJ系统发育树Fig．3 NJ Phylogenetic tree based on rDNA ITS sequences

由图3可知，邻接聚类分析表明香蘑属内多个菌株以较高的支持率聚成3支，其中菌株ts916与数据库中的Lepista sordida聚为一大支；与中国江西、贵州、江苏的3个菌株（序列号分别为MN258660、MZ158191、FJ481015） 亲缘关系更近，ITS核苷酸一致率为99．82%～100．00%；与日本、埃及、中国黑龙江的3个菌株（序列号分别为 KP293583、LN827702、KF874612） 亲缘关系较近，ITS核苷酸一致率为97．95%～98．00%。依此结果将ts916菌株鉴定为花脸香蘑Lepista sordida。

2.3 液体培养基筛选

取10 mL液体培养的菌液于平板中，观察菌株ts916在5个液体培养基配方中的生长情况，见图4，菌丝体生物量等指标结果见表2。

图4 菌株ts916在5个液体培养基中的生长情况Fig.4 Growth situations of strain ts916 cultivated in five liquid cultrue media

表2 不同液体培养基配方对ts916菌株菌丝体生长的影响Tab.2 Effect on mycelial growth conditions of strain ts916 in different liquid media

由图4、表2可知，菌株ts916菌丝在5个配方中菌丝体生物量依次为：配方4>配方2>配方5>配方3>配方1。在配方4中生长最好，菌丝球表面光滑，大小均一，稠密；菌丝体生物量最大，达2.209g·100-1mL-1。

3 讨论与结论

通过使用子实体形态鉴定和rDNA ITS序列分子鉴定相结合的方法，确定所分离的野生菌株ts916为花脸香蘑，为该地区花脸香蘑育种工作提供遗传背景清晰的野生种质资源。

在云南、四川等地有每年采食花脸香蘑的习惯，但花脸香蘑具有人工栽培周期长、生物学效率低、子实体易碎、虫害重等问题限制其规模化、商品化发展，因此菌种的快速扩繁等栽培技术仍是今后花脸香蘑的研究重点。因此，对菌株ts916的液体培养基进行了初步筛选，结果表明，菌株ts916的最适液体培养基为配方4（马铃薯200 g、葡萄糖20 g、酵母膏3 g、玉米粉20 g、麸皮20 g、KH2PO43 g、MgSO41.5 g，加水至1 L，pH自然）。在其他研究中，罗倩[12]得到的花脸香蘑HL-07菌丝体液体发酵最佳条件为蛋白胨0.1%、玉米粉2%；邓功成[13]研究得到花脸香蘑液体发酵最佳条件为玉米粉3%、酵母膏0.2%；胡先运[14]采用正交试验的方法，筛选出适合于花脸香蘑深层发酵培养的配方为，最佳碳源为土豆粉，最佳氮源为NH4Cl，pH为7，无机盐为FeSO4，菌龄12 d。对于花脸香蘑最适液体条件的选择，结果有所不同。其原因可能是：1） 最佳液体培养条件的选择与品种有关；不同品种的花脸香蘑的最佳液体培养条件不同。2） 试验设计时选择的配方和试验方法不同；一些试验中，通过单因素法选择出1种最佳碳源或氮源。但实际生产中，常根据经济情况或就地取材，复合氮源在生产上较为常用。研究中酵母膏、麸皮、玉米粉的复配效果比单独使用麸皮（配方2） 或玉米粉（配方3） 好。在双孢菇（Agaricus bisporus）[15]、大球盖菇 （Stropharia rugosoannulata）[11]等食用菌的液体培养基筛选中也发现，复配氮源可使菌丝球大小均匀、干质量大。

综上，在丰富花脸香蘑的种质资源的基础上，探索出菌丝的生长条件和营养要求，为下一步驯化选育和市场化开发提供技术条件。