青稞秸秆总黄酮提取工艺优化及降血糖活性研究

龙 林，黄 盼，程佩佩，胡 辉，李清安，刘源才，石子林

(1.劲牌持正堂药业有限公司，中国 黄石 435100；2.湖北省中药配方颗粒工程技术研究中心，中国 黄石 435100；3.中药保健食品质量与安全湖北省重点实验室，中国 黄石 435100；4.劲牌研究院，中国 黄石 435100)

青稞(HordeumvulgareLinn.var.nudum Hook.F.)，为禾本科大麦属一年生草本植物[1]。其主要分布于青海、西藏、甘肃以及四川等高海拔地区[2]，其中以西藏地区的种植最广，青稞早已成为藏民心中不可替代的主粮。在藏区，青稞在饲料以及酿造行业也起着无可替代的作用，以青稞酿造而成的青稞酒、青稞啤酒深受社会各界的喜爱。

除此之外，青稞还富含多种氨基酸、蛋白质以及丰富的无机盐、维生素、酚类、甾醇类以及黄酮类等生物活性物质，具有较好的保健功效[3-5]。其中，黄酮类物质具有抗氧化、抑菌、降血脂、降血糖等诸多药理活性，在临床上应用较为广泛[6-8]。目前，对青稞种子中总黄酮的研究较多[9-11]，而对青稞秸秆中总黄酮的研究相对较少，尚未见到对青稞秸秆中总黄酮的相关研究。每到青稞采收的季节，大量的青稞秸秆被遗弃，造成了极大的资源浪费。

据相关文献报道，全球约有9.1%的成年人患有糖尿病，还有6.9%的人由于糖代谢功能受损而存在潜在的患病风险，在这些患者和潜在患者当中，中国的占比位居第一[12-14]。而α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶通过参与小肠内的碳水化合物消化和吸收进而影响着人体餐后的血糖水平，目前市场上常见的降血糖药物有拜糖平、倍欣等，这些药物虽具有一定的功效，但大多都有或多或少的毒副作用，不宜长期服用[15,16]。因此，找到一款天然产物类降血糖类药物也成为了目前研究的热点课题。

本研究以青稞秸秆为对象，对其秸秆总黄酮提取工艺进行优化，并对总黄酮抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性进行探究，旨在提高青稞秸秆的利用率。

1 材料与方法

1.1 主要材料

青稞秸秆(西藏奇正药业有限公司，经劲牌持正堂药业有限公司孙代华研究员鉴定为禾本科大麦属植物青稞HordeumvulgareLinn.var.nudum Hook.F.的茎秆)，α-淀粉酶(>10 U·mg-1) (Sigma公司)、α-葡萄糖苷酶(>50 U·mg-1) (Sigma公司)，蔗糖酶(Sigma公司)，其余试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器

仪表恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器有限公司)，Ultrospec-4300型紫外分光光度计(瑞典GE公司)，TE412-L型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。

1.3 材料预处理

青稞秸秆自然风干至恒定质量后，粉碎，过药典五号筛，将过筛后的青稞秸秆粉末常温避光保存。

1.4 提取方法

精密称取2.0 g青稞秸秆粉末，按照一定的提取温度、提取时间、乙醇体积分数、液料比，水浴冷凝回流提取，提取完毕后，加纯水定容至100 mL，即得供试品溶液。

1.5 芦丁标准曲线的绘制

精密称取干燥至恒重的芦丁标准品40 mg，用体积分数70%的乙醇溶解并定容至100 mL，混匀后即得0.4 g·L-1的芦丁标准品溶液；于25 mL容量瓶中精密滴加1，2，4，6，8，10，12 mL芦丁标准品溶液，依次向容量瓶中滴加质量分数为5%的亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀静置6 min，滴加质量分数为10%的硝酸铝溶液1 mL，摇匀静置6 min，滴加质量分数为4%的氢氧化钠溶液10 mL后用体积分数为70%的乙醇定容至刻度，摇匀静置15 min，以空白样品作对照，并于510 nm处测其吸光度。以芦丁的质量浓度(X)为横坐标，以吸光度(Y)为纵坐标，绘制标准曲线后所得回归方程如下：Y=0.496X-0.015 2(R2=0.999 6)，线性范围：0.04～4.00 g·L-1。

1.6 青稞秸秆总黄酮含量测定

精密量取提取完毕后的青稞秸秆溶液1 mL，按照1.5中的方法显色后结合标准曲线计算青稞秸秆中总黄酮含量。

1.7 青稞秸秆总黄酮提取率测定

青稞秸秆总黄酮提取率=(青稞秸秆总黄酮质量/青稞秸秆粉末质量)×100%。

1.8 青稞秸秆总黄酮提取单因素试验

按照1.4中的提取方法，研究提取温度、提取时间、乙醇体积分数及液料比对青稞秸秆总黄酮提取率的影响。

1.8.1 提取温度 精密称取5.0 g青稞秸秆粉末，固定乙醇体积分数70%、提取时间90 min、液料比40∶1 (mL·g-1)，按提取温度(50,60,70,80,90 ℃)设置梯度试验，研究提取温度对青稞秸秆总黄酮提取率的影响。

1.8.2 提取时间 精密称取5.0 g青稞秸秆粉末，固定乙醇体积分数70%、提取温度80 ℃、液料比40∶1 (mL·g-1)，按提取时间(30,60,90,120,150 min)设置梯度试验，研究提取时间对青稞秸秆总黄酮提取率的影响。

1.8.3 乙醇体积分数 精密称取5.0 g青稞秸秆粉末，固定提取时间120 min、提取温度80 ℃、液料比40∶1 (mL·g-1)，按乙醇体积分数(50%,60%,70%,80%,90%)设置梯度试验，研究乙醇体积分数对青稞秸秆总黄酮提取率的影响。

1.8.4 液料比 精密称取5.0 g青稞秸秆粉末，固定乙醇体积分数60%、提取时间120 min、提取温度80 ℃，按液料比(mL·g-1) (20∶1,30∶1,40∶1,50∶1,60∶1)设置梯度试验，研究液料比对青稞秸秆总黄酮提取率的影响。

1.9 青稞秸秆总黄酮提取工艺响应面优化

在1.8单因素试验基础上，以提取温度，提取时间和液料比3因素为研究对象，以青稞秸秆总黄酮提取率为响应值，按照中心组合试验设计原理设计3因素3水平的响应面试验，以确定3因素对青稞秸秆总黄酮提取率影响的显著性水平以及青稞秸秆总黄酮的最优提取工艺条件。响应面试验因素水平设计如表1所示。

表1 响应面法实验因素水平Table 1 Levels of experimental factors for the response surface method

1.10 青稞秸秆总黄酮生物活性试验

1.10.1α-淀粉酶抑制活性测定 取20 μL青稞秸秆总黄酮溶液(20% DMSO溶解)与200 μLα-淀粉酶溶液37 ℃保温反应40 min；再加入700 μL淀粉溶液，37 ℃保温酶解15 min，之后用100 μL HCl溶液终止反应，加碘显色，测定650 nm处吸光值。计算公式如下：

其中OD样品，OD阴性及OD空白分别为正常实验的吸光值、用无水乙醇代替α-淀粉酶的吸光值及用纯水代替青稞秸秆总黄酮溶液实验的吸光值。

1.10.2α-葡萄糖苷酶抑制活性测定 取20 μL青稞总黄酮溶液与200 μLα-葡萄糖苷酶溶液37 ℃保温反应30 min；再加入700 μL PNPG(对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷)溶液，37 ℃保温酶解15 min，之后用100 μL碳酸钠溶液终止反应，测定405 nm处吸光值。计算公式如下：

其中OD样品，OD阴性及OD空白分别为正常实验的吸光值、用无水乙醇代替α-葡萄糖苷酶的吸光值及用纯水代替青稞秸秆总黄酮溶液实验的吸光值。

2 结果与分析

2.1 青稞秸秆总黄酮提取工艺单因素试验

2.1.1 提取温度 由图1可知，随着提取温度的逐渐上升，青稞秸秆总黄酮提取率呈现先增大后减小的趋势，这可能是因为温度过高导致提取出的总黄酮又被水解，在80 ℃时提取率达到峰值，为1.61%。因此选择青稞秸秆总黄酮提取的最佳温度为80 ℃。

图1 提取温度对青稞秸秆总黄酮提取率的影响Fig. 1 Effect of extraction temperature on the extraction rate of total flavonoids in barley stalks and leaves

2.1.2 提取时间 由图2可知，随着提取时间的增加，青稞秸秆总黄酮提取率呈现先增大后减小的趋势，这可能是因为过长的提取时间会导致所提出的总黄酮部分水解，从而降低了所提总黄酮的浓度，当提取120 min时，此时提取率达到峰值1.72%。因此选择青稞秸秆总黄酮的最佳提取时间为120 min。

图2 提取时间对青稞秸秆总黄酮提取率的影响Fig. 2 Effect of extraction time on the extraction rate of total flavonoids in barley stalks and leaves

2.1.3 乙醇体积分数 由图3可知，青稞秸秆总黄酮提取率随着乙醇体积分数的增加而呈现先增大后减小的趋势，当乙醇体积分数为60%时，此时提取率达到峰值1.82%。故选择提取青稞秸秆总黄酮的最优乙醇体积分数为60%。

图3 乙醇体积分数对青稞秸秆总黄酮提取率的影响Fig. 3 Effect of ethanol volume on the extraction rate of total flavonoids in barley stalks and leaves

2.1.4 液料比 由图4可知，随着液料比的逐渐增大，青稞秸秆总黄酮提取率呈现先增大后减小的趋势，这可能是因为，如果液料比太小会导致青稞秸秆提取不够充分；液料比太大则会导致浓缩的时间过长，从而使得总黄酮有所损失。当液料比为30∶1 (mL·g-1)时，此时提取率达到峰1.92%。故选择青稞秸秆总黄酮提取的最佳液料比为30∶1 (mL·g-1)。

图4 液料比对青稞秸秆总黄酮提取率的影响Fig. 4 Effect of liquid-solid ratio on the extraction rate of total flavonoids in barley stalks and leaves

2.2 响应面法优化青稞秸秆总黄酮提取工艺试验

在单因素试验的基础上，筛选出对青稞秸秆总黄酮提取率影响较大的3个因素：提取温度(A)、提取时间(B)和液料比(C)。以青稞秸秆总黄酮提取率(Y)为响应值，依据Box-Behnken响应面试验的设计原理进行试验设计，设计方案及结果如表2所示，利用Design-Expert 8.0.6软件对表2进行回归分析，所得回归方程如下：

表2 响应面试验设计方案及结果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiment

Y=-7.3+0.152 25A+0.018 5B+0.141 25C-1.67×10-5AB-0.000 15AC+1.67×10-5BC-0.000 925A2-8.06×10-5B2-0.002 075C2。

为了验证回归方程的可行性，以及更好地验证各因素对青稞秸秆总黄酮提取率的影响大小，结合响应面试验结果以及回归方程作方差分析，如表3所示。由表3可知，该模型F值为16.35，P值为0.000 7<0.01，说明该模型差异极显著，具有统计学意义；其失拟差的P值为0.151 4>0.01，差异不显著，表明差异无统计学意义。结合模型的P值和失拟差的P值，说明该回归方程具有良好的拟合性，该实验所造成的误差相对较小。Radj=0.896 2，说明该模型可解释89.62%的响应值的变化，R2=0.954 6进一步验证了该模型的拟合性较为良好。表3中F值表示各因素对响应值Y影响的强弱，F值越大说明该因素对响应值Y的影响越强，由表3中F值可知，C>B>A，说明各因素对青稞秸秆总黄酮提取率影响从大到小为：液料比、提取时间、提取温度。

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

经响应面法优化后，所得最优提取工艺为：提取温度78.74 ℃，提取时间109.95 min，液料比31.64∶1(mL·g-1)的条件下，用体积分数60%的乙醇提取，此时提取率为1.95%。考虑到实际应用的可操作性和便捷性，选择青稞秸秆总黄酮的最优提取工艺为：提取温度78 ℃，提取时间110 min，液料比30∶1(mL·g-1)，用体积分数60%的乙醇提取。平行试验5次后，所得总黄酮提取率为1.92%，与预测值相近，且具有较好的可重复性。

2.3 青稞秸秆总黄酮生物活性试验

2.3.1α-淀粉酶抑制活性测定 以淀粉为底物，使α-淀粉酶与青稞秸秆总黄酮充分作用后，再与淀粉反应。用紫外分光光度计检测反应后各溶液在650 nm处吸光度，结果见表4。

表4 青稞秸秆总黄酮对α-淀粉酶的体外抑制效果Table 4 Inhibitory effect of total flavonoids in barley stalks and leaves on α-amylase in vitro

图5 青稞秸秆总黄酮对α-淀粉酶抑制率 Fig. 5 Inhibitory rates of total flavonoids in barley stalks and leaves on α-amylase

以α-淀粉酶活性抑制率对样品浓度作图，见图5。由图5可知，青稞秸秆总黄酮对α-淀粉酶的抑制作用呈浓度依赖型，较高浓度的青稞秸秆总黄酮才能明显抑制α-淀粉酶活性，其IC50>10 g·L-1，表明青稞秸秆总黄酮对α-淀粉酶活性抑制作用不明显。

2.3.2α-葡萄糖苷酶抑制活性测定 以对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)为底物，使α-葡萄糖苷酶与青稞秸秆总黄酮充分作用后，再与PNPG反应，产物为对硝基苯酚(PNP)，显黄色。用紫外分光光度计测得反应后各溶液在405 nm处吸光度如表5所示。

表5 青稞秸秆总黄酮对α-葡萄糖苷酶的体外抑制作用Table 5 Inhibitory effect of total flavonoids in barley stalks and leaves on α-glucosidase in vitro

以样品浓度和α-葡萄糖苷酶活性抑制率作图，见图6。由图6可知，青稞秸秆总黄酮对α-葡萄糖苷酶抑制作用呈浓度依赖性，较高浓度的青稞秸秆总黄酮能明显抑制α-葡萄糖苷酶活性，其IC50为2.5 g·L-1，表明青稞秸秆总黄酮对α-葡萄糖苷酶活性有一定的抑制作用。

图6 青稞秸秆总黄酮(A)和阳性对照(B)对α-葡萄糖苷酶抑制率Fig. 6 Inhibitory rates of α-glucosidase by total flavonoids in barley stalks and leaves (A) and positive control (B)

3 结论与讨论

本实验采用乙醇回流法对青稞秸秆总黄酮提取工艺进行研究，在单因素实验基础上结合响应面法，对提取工艺进行优化，所得最优提取工艺为：用体积分数60%的乙醇在78 ℃下用30∶1(mL·g-1)的液料比提取110 min，此时总黄酮提取率为1.92%，试验的实测值与预估值差距不大，说明该实验具有较好的预测性。利用α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶对提取的青稞秸秆总黄酮进行活性试验，结果表明青稞秸秆总黄酮对α-淀粉酶活性抑制作用不明显，但对α-葡萄糖苷酶活性有一定的抑制作用，说明所提取的青稞秸秆总黄酮具有一定的生物活性。

青稞是日常生活中的一种极为常见的植物，但人们对青稞秸秆的开发利用还远远不够。本文研究了青稞秸秆总黄酮对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用，青稞秸秆中其他生物活性物质的开发利用有待学者们继续探讨。